Nova družina z RNA vodenih sistemov za ciljanje DNA — drugačna od CRISPR in še ne orodje za urejanje genov

Nova veja na drevesu z RNA vodenih molekularnih strojev

Vsake toliko pride biološki članek z naslovom, ki si ga sam ni izbral. Tokratni je bil »nov CRISPR«. Raziskava v ozadju je zanimivejša od tega — in, kot običajno, skromnejša.

Začnimo s tem, kar je CRISPR proslavil: sistemom, vodenim z RNA. Protein ni nujno vnaprej programiran za prepoznavanje enega samega cilja. Namesto tega nosi kratek kos RNA — vodilo — in gre tja, kjer se zaporedje vodila ujema s tarčo. Spremenite vodilo in spremenite cilj. Prav zaradi te programabilnosti je CRISPR postal orodje. Toda CRISPR ni edini z RNA vodeni sistem v naravi. Ta članek si zastavi potrpežljivo vprašanje: koliko drugih vrst takšnih sistemov obstaja in česa nas lahko naučijo?

Avtorji jih niso iskali po podobnosti genskih zaporedij — ta se skozi dolgo evolucijsko zgodovino preveč spremenijo, da bi razkrivala oddaljene sorodnike. Iskali so oblike. Izhajali so iz dela proteina Cas9 sistema CRISPR, ki drži vodilno RNA, in v zbirkah napovedanih proteinskih struktur iskali karkoli s podobno zgradbo. Sled jih je prek bakterijskega »skakajočega gena« in molekularnega stroja, s katerim običajne celice kemično spreminjajo svojo RNA, pripeljala do nečesa resnično novega.

Kaj so naredili avtorji

Strukturno iskanje je odkrilo prej neprepoznano družino proteinov, ki so zapisani predvsem v bakteriofagih (virusih bakterij), virusih arhej in drobnih parazitskih bakterijah. Vsak se nahaja ob značilnem odseku DNA: dolgem ponavljajočem se nizu, ki so ga avtorji poimenovali niz TIGR (Tandem Interspaced Guide RNA). Proteine so poimenovali Tas (TIGR-associated). Nekateri proteini Tas so zgolj del, ki drži RNA; drugi imajo dodano orodje za rezanje DNA — eno od dveh vrst molekularnih škarij, imenovanih RuvC ali HNH.

Ko so družino našli v podatkovnih zbirkah, so jo prenesli v laboratorij. Sisteme so izrazili v E. coli in sekvencirali majhne RNA, ki so nastale; določili pravila, po katerih te RNA najdejo tarčo v DNA; preverili, ali različice z nukleazami res režejo; eno poskusili programirati za urejanje človeških celic; nato pa delujoči kompleks zamrznili in njegovo strukturo posneli s skoraj atomsko ločljivostjo.

Kaj so ugotovili

Vodilo je sestavljeno iz dveh delov. Niz TIGR se obdela v kratke RNA, dolge približno 36 nukleotidov, od katerih vsaka vsebuje dva ločena ciljna segmenta. En segment bere eno verigo ciljne DNA, drugi nasprotno. Skupaj določita mesto vezave. To je resnična mehanistična razlika od CRISPR, kjer se vodilo v enem neprekinjenem odseku ujema z eno verigo.

In ne potrebuje »pristajalnega mesta«. Številne nukleaze CRISPR lahko režejo le ob kratkem, specifičnem motivu DNA, imenovanem PAM, ki leži poleg tarče. To omejuje, kam jih lahko usmerimo. Sistemi TIGR takšne zahteve niso pokazali: opirali so se samo na ciljno zaporedje. Sistem brez zahteve po PAM je mogoče načeloma usmeriti na več mest.

Različice z nukleazo režejo natančno. Proteini Tas z domenama RuvC ali HNH so pod vodstvom majhne RNA ustvarili čiste, zaporedno specifične prelome DNA — brez vodila pa niso naredili ničesar.

Eno različico je bilo mogoče programirati za urejanje človeških celic — vendar komaj. Ko so protein Tas prenesli v človeške celice v kulturi in ga usmerili na šest različnih genov, je res povzročil spremembe. To potrjuje, da je sistem programabilen tudi v naših celicah. Toda učinkovitost je bila nizka: v najboljšem primeru nekaj odstotkov celic. Za primerjavo, danes optimizirana orodja CRISPR rutinsko uredijo velik delež celic, v katere jih vnesemo. To je dokaz, da sistem lahko deluje, ne da deluje dobro.

Struktura je pojasnila mehanizem — in nakazala izvor. Posneti kompleks sestavljata zrcalno simetrična proteina, ki držita vodilno RNA v obliki osmice, medtem ko je ciljna DNA močno ukrivljena. Presenetljivo je ta arhitektura zelo podobna molekularnemu stroju pri sorodnikih naših celic — box C/D snoRNP, ki z RNA usmerja kemične spremembe drugih RNA, namesto da bi rezal DNA.

Njegova naravna naloga ni jasna. Ko so avtorji en sistem izrazili v E. coli, ni branil celice pred vdirajočimi virusi ali plazmidi — kar je običajna naloga CRISPR. Namesto tega je skozi več generacij postopoma odstranil ciljani plazmid. To nakazuje, da bi njegova prava vloga lahko bila počasna konkurenca med mobilnimi elementi DNA, ne neposredna protivirusna obramba. Toda poskus je potekal v izposojenem, umetnem okolju in pošten odgovor je, da še ne vemo, kaj ti sistemi počnejo v naravi.

Kaj to verjetno pomeni

Dve stvari, z različno stopnjo gotovosti.

Trdna ugotovitev: svet znanih sistemov, vodenih z RNA, je večji in bolj raznolik od CRISPR in njegovih nedavno odkritih sorodnikov. TIGR-Tas je resnično ločena veja z lastnim dvodelnim načinom prepoznavanja DNA brez PAM. To je dejanska razširitev zemljevida.

Globlji in bolj špekulativen sklep: ker je stroj TIGR zgrajen podobno kot snoRNP, ki spreminja RNA v celicah, podobnih našim, in kot znani »skakajoči gen«, bi lahko predstavljal evolucijsko povezavo med z RNA vodenimi sistemi za spreminjanje RNA in z RNA vodenimi sistemi, ki ciljajo DNA — morda manjkajoči člen v zgodbi, kako so se programabilna RNA-vodila pojavila po drevesu življenja.

Česa to ne dokazuje

• To ni pripravljeno orodje za urejanje genov. Urejanje človeških celic so pokazali, vendar je bilo šibko — v najboljšem primeru nekaj odstotkov. To dokazuje programabilnost, ne zrel urejevalnik, in je daleč od česarkoli kliničnega.
• To ni »CRISPR 2.0«. Kot današnje orodje ga CRISPR-Cas9 po učinkovitosti močno prekaša. TIGR-Tas je nova arhitektura na stopnji dokaza koncepta, ne izboljšana različica že obstoječega izdelka.
• Njegova biološka vloga ni znana. V enem testu ni deloval kot protivirusni imunski sistem; trditev o »novem bakterijskem imunskem sistemu« zato ni utemeljena.
• Veliko osnovnega mehanizma ostaja odprtega — med drugim, kako se vodilna RNA obdela do končne dolžine in kaj ti sistemi v naravi dejansko ciljajo (večina jih živi v mikrobih, ki jih je zelo težko gojiti).
• Tu ni nič terapevtskega. Gre za odkritje in karakterizacijo v mikrobih in celični kulturi — brez bolezni, zdravljenja ali bolnikov.

Kako močni so dokazi?

Samo odkritje stoji na trdnih temeljih in je nenavadno celovito: izhaja iz obsežnega strukturnega rudarjenja podatkov, nato laboratorijske potrditve nastanka RNA ter njenega iskanja in rezanja DNA, skoraj atomske strukture delujočega kompleksa ter testa v človeških celicah. Trditev »to je nova, ločena družina z RNA vodenih sistemov za ciljanje DNA« je hkrati podprta z več neodvisnih strani.

Zgodaj je vse, kar zadeva uporabnost: urejanje deluje, vendar komaj, in vsa optimizacija, ki je CRISPR spremenila iz zanimivosti v orodje, je pri TIGR še pred nami. Sklepanje pa ostaja pri preostanku zgodbe — naravna vloga je razumna domneva iz umetnega poskusa, evolucijska povezava pa je, čeprav elegantna, argument iz podobnosti strukture, ne dokončno rekonstruirana zgodovina. Članek skrbno ločuje med temi ravnmi.

Zakaj je pomembno

Več prejšnjih razširitev kataloga z RNA vodenih sistemov se je pozneje izkazalo za uporabnih. Sistemi za današnjimi orodji — Cas9, Cas12, Cas13, pozneje manjši proteini IscB/OMEGA in evkariontski Fanzorji — so bili sprva le na novo opisana biologija. Nobeden ni prišel kot končano orodje. Sistem z dvodelnim vodilom in brez zahteve po PAM je resnično drugačno izhodišče, ciljanje brez PAM pa je prav tista vrsta prilagodljivosti, ki jo razvijalci orodij cenijo.

Toda tišji rezultat je morda pomembnejši od možnosti za novo orodje. S povezovanjem sistema za rezanje DNA z RNA-spreminjajočim strojem snoRNP in s skakajočim genom delo nakaže možno nit med zelo različnimi z RNA vodenimi sistemi po drevesu življenja. Takšna ugotovitev lahko spremeni razumevanje področja o tem, od kod so prišla njegova orodja — in je dolgoročno vrednejša od še enega naslova o molekularnih škarjah.

Kratek povzetek

Z iskanjem proteinskih oblik namesto podobnih zaporedij so raziskovalci odkrili TIGR-Tas: prej neznano družino z RNA vodenih sistemov za ciljanje DNA, ki jo najdemo predvsem v bakterijskih virusih in parazitskih bakterijah. Njena vodilna RNA je nenavadna — dolga je približno 36 nukleotidov in nosi dva ločena ciljna segmenta, ki bereta nasprotni verigi DNA — ter za razliko od CRISPR ne potrebuje sosednjega motiva PAM. Člani družine z nukleazami natančno režejo DNA, eno različico je bilo mogoče programirati za urejanje človeških celic (vendar le z nekajodstotno učinkovitostjo), skoraj atomska struktura pa je razkrila kompleks, zgrajen podobno kot stroj snoRNP, ki spreminja RNA v naših celicah. To nakazuje globoko evolucijsko povezavo med z RNA vodenimi sistemi za spreminjanje RNA in ciljanje DNA. Gre za resnično razširitev biologije, vodene z RNA, in morda novo ogrodje za prihodnja orodja — temeljno odkritje in dokaz koncepta, ne zrel urejevalnik genov, ne »CRISPR 2.0« in ne terapijo. Njegova naravna vloga ostaja neznana.

Preverjanje brez olepševanja

Kaj članek kaže: Novo, ločeno družino z RNA vodenih sistemov za ciljanje DNA (TIGR-Tas) pri prokariontih in njihovih virusih, odkrito s strukturnim rudarjenjem; vodilno RNA z dvema ciljnima segmentoma brez PAM (~36 nt), ki skupaj ciljata obe verigi DNA; natančno z RNA vodeno rezanje DNA pri članih z nukleazami; programabilno urejanje človeških celic z nizko učinkovitostjo (do nekaj odstotkov); skoraj atomsko strukturo cryo-EM; ter strukturne/evolucijske povezave z box C/D snoRNP in transpozoni IS110.

Kaj je verjetno, vendar ni dokazano: Naravna biološka vloga sistemov (en umetni poskus nakazuje vlogo pri konkurenci med mobilnimi elementi, ne pri obrambi); predlagani evolucijski most med z RNA vodenimi sistemi za spreminjanje RNA in ciljanje DNA (argument na podlagi strukture).

Česa ne kaže: Zrelega ali zelo učinkovitega orodja za urejanje genov; premoči nad CRISPR kot orodjem; potrjene naravne funkcije; načina, kako vodilna RNA dozori; kakršnekoli terapevtske uporabe.

Glavne omejitve: Učinkovitost urejanja človeških celic je nizka (le dokaz koncepta); večina sistemov izvira iz težko preučljivih metagenomov, zato njihove naravne tarče večinoma niso znane; trditve o biološki vlogi in evolucijskem izvoru so sklepne; karakterizacija je bila izvedena v mikrobih in celični kulturi, ne v kontekstu bolezni.

Koliko zaupanja naj ima splošni bralec? Visoko, da gre za resnično novo in ločeno družino z RNA vodenih sistemov za ciljanje DNA z novim dvodelnim mehanizmom brez PAM ter da so strukturne ugotovitve trdne. Prav tako visoko, da to ni pripravljeno orodje za urejanje genov, ni »CRISPR 2.0« in ni terapija. Nizko glede naravne vloge in tega, kako uspešno bi lahko nekoč postalo kot orodje. Primerna drža: upravičeno navdušenje nad novo biologijo in možnim evolucijskim manjkajočim členom — ter potrpežljivost glede aplikacij, ki so šele na začetku.