Familia mpya ya mifumo inayolenga DNA kwa mwongozo wa RNA — tofauti na CRISPR, na bado si zana ya kuhariri jeni

Tawi jipya katika mti wa mashine zinazoongozwa na RNA

Mara kwa mara, makala ya biolojia hujitokeza ikiwa imevalishwa kichwa cha habari ambacho haikuwahi kuomba. Kwa hii, kilikuwa “CRISPR mpya.” Kazi iliyo nyuma yake inavutia zaidi kuliko hivyo — na, kama kawaida, ni ya kiasi zaidi.

Tuanze na kile CRISPR ilichofanya kijulikane: mfumo unaoongozwa na RNA. Ujanja wake ni kwamba protini haihitaji kujengwa tangu mwanzo ili itambue shabaha moja tu. Badala yake, hubeba kipande kifupi cha RNA — mwongozo — na kwenda popote ambapo mfuatano wa mwongozo huo unalingana. Badilisha mwongozo, unabadilisha shabaha. Uwezo huo wa kupangiliwa ndio sababu kuu CRISPR ikawa chombo muhimu. Lakini CRISPR si mfumo pekee wa asili unaoongozwa na RNA, na swali la makala hii ni la uvumilivu: kuna aina nyingine ngapi, na zinaweza kutufundisha nini?

Ili kuzitafuta, waandishi hawakutafuta mfuatano wa jeni unaofanana — mfuatano huo hubadilika sana katika muda wa mageuzi kiasi kwamba jamaa wa mbali huwa vigumu kutambulika. Walitafuta maumbo. Wakianzia sehemu ya protini Cas9 ya CRISPR inayoshika RNA yake ya mwongozo, walichunguza hifadhidata za maumbo ya protini yaliyotabiriwa ili kupata chochote kilichojengwa kwa namna hiyo. Njia hiyo iliwaongoza — kupitia “jeni linaloruka” la bakteria na kipande cha mashine ambacho seli za kawaida hutumia kurekebisha RNA zao kikemia — hadi kitu kipya kweli.

Walichofanya waandishi

Utafutaji wa miundo ulifichua familia ya protini ambayo haikuwa imetambuliwa hapo awali, iliyosimbwa hasa katika bacteriophages (virusi vinavyoambukiza bakteria), virusi vya archaea, na bakteria wadogo wa vimelea. Kila protini iko karibu na eneo maalum la DNA: safu ndefu inayojirudia ambayo waandishi waliita TIGR array (Tandem Interspaced Guide RNA). Protini hizo waliita Tas (TIGR-associated). Baadhi ya protini za Tas zina sehemu ya kushika RNA pekee; nyingine zimeunganishwa na zana ya kukata DNA — mojawapo ya aina mbili za “mkasi” wa molekuli (RuvC au HNH).

Baada ya kuipata familia hii kwenye hifadhidata, waliipeleka maabara: waliifanya mifumo hiyo ijieleze katika E. coli na wakasoma kwa mpangilio RNA ndogo ilizotengeneza, wakabaini kanuni ambazo RNA hizo hutumia kupata shabaha ya DNA, wakajaribu kama toleo zenye uwezo wa kukata hukata kweli, wakajaribu kupanga moja ili kuhariri seli za binadamu, na hatimaye wakagandisha mchanganyiko unaofanya kazi na kuupiga picha kwa azimio karibu na kiwango cha atomu.

Walichogundua

Mwongozo una sehemu mbili. TIGR array huchakatwa kuwa RNA fupi za takriban herufi 36, kila moja ikiwa na sehemu mbili tofauti za kulenga. Sehemu moja husoma uzi mmoja wa DNA lengwa; nyingine husoma uzi unaokabiliana. Hufanya kazi kwa pamoja ili kubainisha eneo. Hii ni tofauti halisi ya kiutaratibu na CRISPR, ambako mwongozo hulingana na uzi mmoja katika kipande kimoja kinachoendelea.

Na haihitaji “eneo la kutua.” Nuclease nyingi za CRISPR zinaweza kukata tu karibu na motifu fupi maalum ya DNA (“PAM”) iliyo pembeni mwa shabaha — kizuizi kinachopunguza maeneo wanayoweza kulenga. Mifumo ya TIGR haikuonyesha hitaji hilo: ilitegemea mfuatano wa shabaha pekee. Mfumo usiohitaji PAM, kwa kanuni, unaweza kuelekezwa katika maeneo mengi zaidi.

Toleo zenye uwezo wa kukata hukata kwa usahihi. Zikiongozwa na RNA ndogo, protini za Tas zenye RuvC au HNH zilitengeneza mikato safi na maalum kwa mfuatano katika DNA — na hazikufanya chochote bila mwongozo.

Toleo moja liliweza kupangiliwa kuhariri seli za binadamu — kwa kiwango kidogo sana. Lilipowekwa katika seli za binadamu kwenye sahani na kuelekezwa kwenye jeni sita tofauti, protini ya Tas ilifanya mabadiliko, ikithibitisha kwamba mfumo unaweza kupangiliwa katika seli zetu pia. Lakini ufanisi ulikuwa mdogo: kwa kiwango bora, asilimia chache tu za seli. Kwa kulinganisha, zana za CRISPR zilizoboreshwa leo huhariri mara kwa mara sehemu kubwa ya seli zinapowekwa. Huu ni uthibitisho kwamba inaweza kufanya kazi, si chombo kinachofanya kazi vizuri.

Muundo ulieleza utaratibu — na ukaashiria asili yake. Mchanganyiko uliopigwa picha ni jozi ya protini yenye ulinganifu wa kioo inayoshika RNA mwongozo yenye umbo la nane, huku DNA lengwa ikipinda kwa kona kali. Cha kushangaza, usanifu huo unafanana sana na mashine inayopatikana katika jamaa za seli zetu — box C/D “snoRNP,” ambayo huongoza marekebisho ya kikemia ya RNA badala ya kukata DNA.

Kazi yake ya asili haijulikani. Waandishi walipoeleza mfumo mmoja katika E. coli, haukuzuia virusi au plasmidi zinazovamia — kazi kuu ya CRISPR. Badala yake, uliondoa polepole plasmidi iliyolengwa baada ya vizazi vingi, jambo linalodokeza kuwa jukumu lake halisi linaweza kuwa katika ushindani wa polepole kati ya vipande vinavyohama vya DNA badala ya ulinzi wa kinga wa mstari wa mbele. Lakini huu ulikuwa mazingira ya kuazima na ya bandia, na jibu la uaminifu ni kwamba bado hakuna anayejua mifumo hii hufanya nini porini.

Huenda hii inamaanisha nini

Mambo mawili, kwa viwango tofauti vya uhakika.

La kwanza ni imara: ulimwengu unaojulikana wa mifumo inayoongozwa na RNA ni mpana na wenye utofauti zaidi kuliko CRISPR na jamaa zake zilizogunduliwa hivi karibuni. TIGR-Tas ni tawi tofauti kweli, lenye namna yake ya sehemu mbili na isiyohitaji PAM ya kutambua DNA. Hilo ni nyongeza halisi kwenye ramani.

La pili ni la kina zaidi lakini la kukisia zaidi: kwa sababu mashine za TIGR zimejengwa kama snoRNP inayohariri RNA katika seli kama zetu, na kama “jeni linaloruka” linalojulikana, zinaweza kuwakilisha kiungo cha mageuzi kati ya mifumo inayoongozwa na RNA inayorekebisha RNA na ile inayolenga DNA — labda kipande kilichokosekana katika historia ya jinsi miongozo ya RNA inayoweza kupangiliwa ilivyoibuka katika uhai.

Hili halithibitishi nini

• Si zana ya kuhariri jeni iliyo tayari. Uhariri katika seli za binadamu ulionyeshwa lakini ulikuwa dhaifu — asilimia chache tu kwa kiwango bora. Huo ni uthibitisho wa uwezo wa kupangiliwa, si kihariri kilichokomaa, na uko mbali sana na matumizi ya kliniki.
• Si “CRISPR 2.0.” Ikiangaliwa kama zana leo, CRISPR-Cas9 huihariri DNA kwa ufanisi mkubwa zaidi. TIGR-Tas ni usanifu mpya katika hatua ya uthibitisho wa dhana, si toleo bora la bidhaa iliyopo.
• Jukumu lake la kibaolojia halijulikani. Halikufanya kama mfumo wa kinga dhidi ya virusi katika jaribio moja la wazo hilo; madai ya “mfumo mpya wa kinga wa bakteria” hayajathibitishwa.
• Sehemu kubwa ya utaratibu wa msingi bado haijajulikana — ikiwemo jinsi RNA mwongozo hukatwa kufikia urefu wake wa mwisho, na mifumo hii hulenga nini hasa katika asili (mingi iko katika vijidudu ambavyo ni vigumu sana kuvikuza).
• Hakuna tiba hapa. Huu ni ugunduzi na uainishaji katika vijidudu na utamaduni wa seli — hakuna ugonjwa, hakuna matibabu, hakuna mgonjwa.

Ushahidi una nguvu kiasi gani?

Ugunduzi wenyewe uko kwenye msingi imara, na kwa namna isiyo ya kawaida umezungukwa vizuri na aina tofauti za ushahidi: unatokana na uchimbaji mkubwa wa miundo, kisha uthibitisho wa maabara wa jinsi RNA inavyotengenezwa na jinsi inavyopata na kukata DNA, kisha muundo wa karibu na kiwango cha atomu wa mchanganyiko ukiwa unafanya kazi, pamoja na jaribio katika seli za binadamu. Dai kwamba “hii ni familia mpya, tofauti, inayolenga DNA kwa mwongozo wa RNA” linaungwa mkono kutoka pande kadhaa kwa wakati mmoja.

Kilicho cha mapema ni kila kitu kuhusu matumizi: uhariri hufanya kazi lakini kwa shida, na uboreshaji wote ulioibadilisha CRISPR kutoka jambo la kuvutia kuwa zana bado uko mbele kwa TIGR. Na kilicho cha hitimisho la kimantiki ni sehemu nyingine ya simulizi — jukumu la asili ni dhana yenye mantiki kutokana na jaribio bandia, na kiungo cha mageuzi, ingawa ni kizuri, ni hoja inayotokana na muundo unaoshirikiwa, si historia iliyokwisha thibitishwa. Makala yenyewe ni makini kutenganisha mambo hayo.

Kwa nini ni muhimu

Upanuzi kadhaa uliopita wa katalogi ya mifumo inayoongozwa na RNA baadaye ulileta manufaa. Mifumo iliyo nyuma ya zana za leo — Cas9, Cas12, Cas13, na hivi karibuni protini ndogo za IscB/OMEGA na Fanzor za eukaryote — kila moja, mwanzoni, ilikuwa biolojia mpya tu iliyokuwa imeelezwa. Hakuna iliyowasili kama zana iliyokamilika. Mfumo wenye mwongozo wa sehemu mbili na usiohitaji PAM ni mahali tofauti kabisa pa kuanzia, na uwezo wa kulenga bila PAM ndio aina ya unyumbufu ambayo watengenezaji wa zana huithamini.

Lakini matokeo tulivu zaidi yanaweza kuwa muhimu zaidi kuliko matarajio ya zana. Kwa kuunganisha mfumo wa kukata DNA na mashine ya snoRNP inayohariri RNA na pia na jeni linaloruka, kazi hii inachora uzi unaowezekana unaounganisha mifumo tofauti sana inayoongozwa na RNA katika mti wa uhai. Huo ni aina ya ugunduzi unaoweza kupanga upya namna taaluma inavyoelewa zana zake zilitoka wapi — jambo ambalo, kwa muda mrefu, lina thamani zaidi kuliko kichwa kingine cha habari kuhusu “mkasi.”

Muhtasari safi

Kwa kutafuta maumbo ya protini badala ya mfuatano, watafiti waligundua TIGR-Tas: familia ambayo haikujulikana hapo awali ya mifumo inayolenga DNA kwa mwongozo wa RNA, inayopatikana hasa katika virusi vya bakteria na bakteria wa vimelea. RNA yake ya mwongozo si ya kawaida — takriban herufi 36 zenye sehemu mbili tofauti za kulenga zinazosomea nyuzi zinazokabiliana za DNA — na, tofauti na CRISPR, haihitaji motifu ya jirani ya “PAM.” Wanachama wenye uwezo wa kukata DNA walikata kwa usahihi, mmoja aliweza kupangiliwa kuhariri seli za binadamu (ingawa kwa ufanisi wa asilimia chache tu), na muundo wa karibu na kiwango cha atomu ulifichua mchanganyiko uliojengwa kama mashine ya snoRNP inayohariri RNA katika seli zetu — jambo linalodokeza kiungo cha kina cha mageuzi kati ya mifumo inayoongozwa na RNA inayorekebisha RNA na ile inayolenga DNA. Ni upanuzi halisi wa biolojia inayoongozwa na RNA na labda chassis mpya kwa zana za baadaye — ugunduzi wa sayansi ya msingi na uthibitisho wa dhana, si kihariri cha jeni kilichokomaa, si “CRISPR 2.0,” na si tiba. Kazi yake ya asili porini bado haijulikani.

Ukaguzi bila kupamba

Makala inaonyesha nini: Familia mpya na tofauti ya mifumo inayolenga DNA kwa mwongozo wa RNA (TIGR-Tas) katika prokaryote na virusi vyao, iliyopatikana kwa uchimbaji wa miundo; RNA mwongozo yenye sehemu mbili, isiyohitaji PAM (~36 nt), inayolenga nyuzi zote mbili za DNA kwa pamoja; kukatwa kwa DNA kwa usahihi na kwa mwongozo wa RNA na wanachama wenye nuclease; uhariri unaoweza kupangiliwa katika seli za binadamu kwa ufanisi mdogo (hadi asilimia chache); muundo wa cryo-EM wa karibu na kiwango cha atomu; na uhusiano wa kimuundo/mageuzi na box C/D snoRNP na transposon za IS110.

Kinachowezekana lakini hakijathibitishwa: Jukumu la asili la kibaolojia la mifumo hiyo (jukumu lisilo la ulinzi katika ushindani wa vipengele vinavyohama linadokezwa na jaribio moja bandia); daraja la mageuzi lililopendekezwa kati ya mifumo inayoongozwa na RNA ya kurekebisha RNA na ile ya kulenga DNA (hoja ya kimuundo).

Isichoonyeshwa: Zana iliyokomaa au yenye ufanisi mkubwa ya kuhariri jeni; ubora kuliko CRISPR kama zana; kazi ya asili iliyothibitishwa; jinsi RNA mwongozo hukomazwa; matumizi yoyote ya tiba.

Vikwazo vikuu: Ufanisi wa uhariri katika seli za binadamu ni mdogo (uthibitisho wa dhana tu); mifumo mingi iko katika metagenome ambazo ni vigumu kusoma, hivyo malengo ya asili kwa kiasi kikubwa hayajulikani; madai ya jukumu la kibaolojia na asili ya mageuzi ni ya kimantiki; uainishaji umefanyika katika vijidudu na utamaduni wa seli, si katika mazingira ya ugonjwa.

Msomaji wa kawaida anapaswa kuwa na uhakika kiasi gani? Uhakika mkubwa kwamba hii ni familia halisi na tofauti ya mifumo inayolenga DNA kwa mwongozo wa RNA yenye utaratibu mpya wa sehemu mbili usiohitaji PAM, na kwamba maarifa ya kimuundo na ya mageuzi ni ya kweli. Uhakika mkubwa pia kwamba si zana ya kuhariri jeni iliyo tayari, si “CRISPR 2.0,” na si tiba. Uhakika mdogo kuhusu kazi yake ya asili na kuhusu itafika mbali kiasi gani kama zana. Msimamo unaofaa: msisimko wa kweli kuhusu biolojia mpya na kiungo kinachowezekana cha mageuzi — pamoja na subira kuhusu matumizi, ambayo yako mwanzoni kabisa.