En ny familie af RNA-styrede systemer, der målretter DNA — forskellig fra CRISPR og endnu ikke et genredigeringsværktøj

En ny gren på træet af RNA-styrede maskiner

Med jævne mellemrum dukker en biologisk artikel op med en overskrift, den aldrig har bedt om. Denne fik overskriften “en ny CRISPR”. Arbejdet bag den er mere interessant end som så — og som sædvanlig mere beskedent.

Begynd med det, der gjorde CRISPR berømt: et RNA-styret system. Tricket er, at proteinet ikke behøver at være fast programmeret til at genkende ét bestemt mål. I stedet bærer det et kort stykke RNA — en guide — og bevæger sig derhen, hvor guidens sekvens matcher. Skift guiden, skift målet. Den programmerbarhed er hele grunden til, at CRISPR blev et værktøj. Men CRISPR er ikke det eneste RNA-styrede system i naturen, og det spørgsmål, denne artikel stiller, er det tålmodige: Hvor mange andre slags findes der, og hvad kan de lære os?

For at lede efter dem søgte forfatterne ikke efter matchende gensekvenser — de ændrer sig for meget gennem evolutionen til at afsløre fjerne slægtninge. De søgte efter former. Med udgangspunkt i den del af CRISPR-proteinet Cas9, der griber fat i dets guide-RNA, gennemgik de databaser over forudsagte proteinstrukturer for at finde noget, der var bygget på samme måde. Det spor førte — via et bakterielt “springende gen” og en del af det maskineri, som almindelige celler bruger til kemisk at ændre deres eget RNA — til noget virkelig nyt.

Hvad forfatterne gjorde

Struktursøgningen fandt en hidtil ukendt familie af proteiner, som hovedsageligt er kodet i bakteriofager (virus, der inficerer bakterier), i virus hos arkæer og i meget små parasitiske bakterier. Hvert af dem ligger ved siden af en karakteristisk DNA-strækning: en lang, gentaget række, som forfatterne kaldte en TIGR-række (for Tandem Interspaced Guide RNA). De kaldte proteinerne Tas (TIGR-associated). Nogle Tas-proteiner består kun af den nøgne RNA-gribende del; andre har et DNA-klippende værktøj — en af to slags molekylære sakse (kaldet RuvC eller HNH) — monteret på.

Efter at have fundet familien i databasen tog de den så med i laboratoriet: De udtrykte systemerne i E. coli og sekventerede de små RNA’er, de dannede, klarlagde reglerne for, hvordan disse RNA’er finder et DNA-mål, testede, om de klippende varianter faktisk klippede, forsøgte at programmere en af dem til at redigere menneskeceller og frøs til sidst et fungerende kompleks og afbildede dets struktur med næsten atomar opløsning.

Hvad de fandt

Guiden består af to dele. TIGR-rækken bearbejdes til korte RNA’er på omkring 36 bogstaver, som hver indeholder to separate målretningssegmenter. Det ene segment aflæser den ene streng i mål-DNA’et; det andet aflæser den modsatte streng. De to arbejder sammen om at fastholde et sted. Det er en reel mekanistisk afvigelse fra CRISPR, hvis guide matcher en enkelt streng i én sammenhængende strækning.

Og den behøver ingen “landingsplads”. Mange CRISPR-nukleaser kan kun klippe ved siden af et kort, specifikt DNA-motiv (et “PAM”), som ligger tæt på målet — en begrænsning, der indskrænker, hvor de kan rettes hen. TIGR-systemerne viste ikke noget sådant krav: De var alene afhængige af målsekvensen. Et system, der ikke behøver et PAM, kan i princippet rettes mod flere steder.

De klippende varianter klipper, præcist. Styret af det lille RNA skabte de RuvC- og HNH-bærende Tas-proteiner rene, sekvensspecifikke brud i DNA — og gjorde intet uden guiden.

Én variant kunne programmeres til at redigere menneskeceller — med nød og næppe. Da et Tas-protein blev flyttet ind i menneskeceller i en skål og rettet mod seks forskellige gener, foretog det faktisk redigeringer, hvilket bekræfter, at systemet også kan programmeres i vores celler. Men effektiviteten var lav: i bedste fald nogle få procent af cellerne. Til sammenligning redigerer nutidens optimerede CRISPR-værktøjer rutinemæssigt en stor andel af de celler, de føres ind i. Det er et bevis på, at det kan virke, ikke et værktøj, der virker godt.

Strukturen forklarede mekanismen — og antydede dens oprindelse. Det afbildede kompleks er et spejlsymmetrisk par af proteiner, der omslutter det ottetalsformede guide-RNA, mens mål-DNA’et bøjes i et skarpt sving. Påfaldende nok ligner denne arkitektur i høj grad en maskine, der findes hos slægtninge til vores egne celler — boks C/D-“snoRNP”, som styrer kemiske ændringer af RNA i stedet for at klippe DNA.

Dets naturlige opgave er uklar. Da forfatterne udtrykte ét system i E. coli, afværgede det ikke invaderende virus eller plasmider — CRISPR’s normale opgave. I stedet fjernede det gradvist et målrettet plasmid gennem mange generationer, hvilket antyder, at dets egentlige rolle kan ligge i langsom konkurrence mellem mobile stykker DNA snarere end i immunforsvarets frontlinje. Men dette var et lånt, kunstigt miljø, og det ærlige svar er, at ingen endnu ved, hvad disse systemer gør i naturen.

Hvad dette sandsynligvis betyder

To ting, med forskellig grad af sikkerhed.

Den sikre: Den kendte verden af RNA-styrede systemer er større og mere varieret end CRISPR og dets nyligt fundne slægtninge. TIGR-Tas er en reelt særskilt gren med sin egen todelte, PAM-frie måde at genkende DNA på. Det er en reel tilføjelse til kortet.

Den dybere og mere spekulative: Fordi TIGR-maskineriet er bygget som det snoRNP, der redigerer RNA i celler som vores, og som et kendt “springende gen”, kan det markere en evolutionær forbindelse mellem RNA-styrede systemer, der modificerer RNA, og RNA-styrede systemer, der målretter DNA — en mulig manglende brik i historien om, hvordan programmerbare RNA-guider opstod på tværs af livet.

Hvad dette ikke beviser

• Det er ikke et færdigt genredigeringsværktøj. Redigering i menneskeceller blev demonstreret, men var svag — i bedste fald nogle få procent. Det er bevis på programmerbarhed, ikke en moden editor, og langt fra noget klinisk.
• Det er ikke “CRISPR 2.0”. Målt som værktøj i dag redigerer CRISPR-Cas9 langt mere effektivt. TIGR-Tas er en ny arkitektur på principbevisstadiet, ikke en bedre version af et eksisterende produkt.
• Dets biologiske rolle er ukendt. Det fungerede ikke som et antiviralt immunsystem i den ene test af denne idé; “et nyt bakterielt immunsystem” er ikke påvist.
• Meget af den grundlæggende mekanisme er stadig uafklaret — herunder hvordan guide-RNA’et klippes til sin endelige længde, og hvad disse systemer faktisk retter sig mod i naturen (de fleste findes i mikrober, vi knap nok kan dyrke).
• Der er intet terapeutisk her. Dette er opdagelse og karakterisering i mikrober og cellekultur — ingen sygdom, ingen behandling, ingen patient.

Hvor stærk er evidensen?

Selve opdagelsen står på sikker grund og er usædvanligt alsidigt underbygget: Den hviler på strukturel kortlægning i stor skala, derefter laboratoriebekræftelse af, hvordan RNA’et dannes, og hvordan det finder og klipper DNA, så en næsten atomar struktur af komplekset i funktion samt testen i menneskeceller. Påstanden “dette er en ny, særskilt familie af RNA-styrede systemer, der målretter DNA” er godt understøttet fra flere sider på én gang.

Det, der er på et tidligt stadie, er alt vedrørende anvendelighed: Redigeringen virker, men knap nok, og al den optimering, som forvandlede CRISPR fra kuriositet til værktøj, ligger for TIGR stadig forude. Og det, der er baseret på slutninger, er resten af historien — den naturlige rolle er et rimeligt gæt ud fra et kunstigt eksperiment, og den evolutionære forbindelse er, hvor elegant den end er, et argument ud fra fælles struktur, ikke en fastslået historie. Artiklen er omhyggelig med at skelne mellem de to.

Hvorfor det er vigtigt

Flere tidligere udvidelser af kataloget over RNA-styrede systemer har med tiden båret frugt. Systemerne bag nutidens værktøjer — Cas9, Cas12, Cas13 og, for nylig, de mindre IscB/OMEGA-proteiner og de eukaryote Fanzor-proteiner — var alle til at begynde med blot nybeskrevet biologi. Ingen af dem ankom som et færdigt værktøj. Et system med en todelt guide og uden krav om PAM er et reelt anderledes udgangspunkt, og PAM-fri målretning er netop den slags fleksibilitet, som værktøjsudviklere værdsætter.

Men det mere stille resultat kan være vigtigere end udsigten til et værktøj. Ved at forbinde et DNA-klippende system med det RNA-redigerende snoRNP-maskineri og med et springende gen skitserer arbejdet en mulig tråd, der forbinder vidt forskellige RNA-styrede systemer på tværs af livets træ. Det er den slags fund, der omorganiserer et fagfelts forståelse af, hvor dets værktøjer kommer fra — hvilket i det lange løb er mere værd end endnu en overskrift om sakse.

Ren opsummering

Ved at søge efter proteiners former i stedet for sekvenser opdagede forskere TIGR-Tas: en hidtil ukendt familie af RNA-styrede systemer, der målretter DNA, og som hovedsageligt findes i bakterievirus og parasitiske bakterier. Dets guide-RNA er usædvanligt — omkring 36 bogstaver med to separate målretningssegmenter, der aflæser modsatte DNA-strenge — og i modsætning til CRISPR behøver det ikke noget tilstødende “PAM”-motiv. De DNA-klippende medlemmer klipper præcist, ét af dem kunne programmeres til at redigere menneskeceller (dog kun med nogle få procents effektivitet), og en næsten atomar struktur viste et kompleks bygget som det snoRNP-maskineri, der redigerer RNA i vores egne celler — hvilket antyder en dyb evolutionær forbindelse mellem RNA-styrede systemer, der modificerer RNA, og systemer, der målretter DNA. Det er en reel udvidelse af den RNA-styrede biologi og et muligt nyt chassis for fremtidige værktøjer — en grundvidenskabelig opdagelse og et principbevis, ikke en moden geneditor, ikke “CRISPR 2.0” og ikke en terapi. Dets naturlige opgave i det fri er stadig ukendt.

Kontrol uden omsvøb

Hvad artiklen viser: En ny, særskilt familie af RNA-styrede systemer, der målretter DNA (TIGR-Tas), i prokaryoter og deres virus, fundet gennem strukturel kortlægning; et guide-RNA med to segmenter, uden PAM (~36 nt), som målretter begge DNA-strenge sammen; præcis RNA-styret DNA-kløvning udført af de nukleasebærende medlemmer; programmerbar redigering i menneskeceller med lav effektivitet (op til nogle få procent); en næsten atomar cryo-EM-struktur; og strukturelle/evolutionære forbindelser til boks C/D-snoRNP’er og IS110-transposoner.

Hvad der er plausibelt, men ikke bevist: Systemernes naturlige biologiske rolle (en anden rolle end forsvar i konkurrence mellem mobile elementer antydes af ét kunstigt eksperiment); den foreslåede evolutionære bro mellem RNA-modificerende og DNA-målrettende RNA-styrede systemer (et strukturelt argument).

Hvad den ikke viser: Et modent eller højeffektivt genredigeringsværktøj; overlegenhed i forhold til CRISPR som værktøj; en bekræftet naturlig funktion; hvordan guide-RNA’et modnes; nogen terapeutisk anvendelse.

Vigtigste begrænsninger: Redigeringseffektiviteten i menneskeceller er lav (kun et principbevis); de fleste systemer findes i metagenomer, der er svære at studere, så de naturlige mål er stort set ukendte; påstandene om biologisk rolle og evolutionær oprindelse er baseret på slutninger; karakteriseringen er foretaget i mikrober og cellekultur, ikke i nogen sygdomssammenhæng.

Hvor stor tillid bør en almindelig læser have? Høj tillid til, at dette er en ægte, særskilt ny familie af RNA-styrede systemer, der målretter DNA, med en ny todelt, PAM-fri mekanisme, og til, at de strukturelle og evolutionære indsigter er reelle. Høj tillid til, at det ikke er et færdigt genredigeringsværktøj, ikke “CRISPR 2.0” og ikke en terapi. Lav tillid, når det gælder dets naturlige rolle, og hvor langt det vil nå som værktøj. Passende holdning: ægte begejstring over ny biologi og en mulig manglende evolutionær forbindelse — og tålmodighed med anvendelserne, som befinder sig helt i begyndelsen.