En ny familie av RNA-styrte systemer som målretter DNA — forskjellig fra CRISPR og ennå ikke et genredigeringsverktøy

En ny gren på treet av RNA-styrte maskiner

Med jevne mellomrom dukker det opp en biologisk studie med en overskrift den aldri ba om. Denne fikk overskriften “en ny CRISPR”. Arbeidet bak den er mer interessant enn som så — og som vanlig mer beskjedent.

Begynn med det som gjorde CRISPR berømt: et RNA-styrt system. Trikset er at proteinet ikke trenger å være fast programmert til å gjenkjenne ett bestemt mål. I stedet bærer det med seg en kort bit RNA — en guide — og drar dit guidens sekvens passer. Bytt guide, bytt mål. Denne programmerbarheten er hele grunnen til at CRISPR ble et verktøy. Men CRISPR er ikke det eneste RNA-styrte systemet i naturen, og spørsmålet denne studien stiller, er det tålmodige: Hvor mange andre typer finnes der ute, og hva kan de lære oss?

For å lete etter dem søkte forfatterne ikke etter samsvarende gensekvenser — de endrer seg for mye gjennom evolusjonen til å avsløre fjerne slektninger. De lette etter former. Med utgangspunkt i den delen av CRISPR-proteinet Cas9 som griper fatt i guide-RNA-et, lette de gjennom databaser med predikerte proteinstrukturer etter noe som var bygget på samme måte. Dette sporet førte — via et bakterielt “hoppende gen” og en del av maskineriet som vanlige celler bruker til å modifisere sitt eget RNA kjemisk — til noe virkelig nytt.

Hva forfatterne gjorde

Struktursøket avdekket en tidligere ukjent familie av proteiner, som for det meste er kodet i bakteriofager (virus som infiserer bakterier), i virus hos arkéer og i svært små parasittiske bakterier. Hvert av dem ligger ved siden av en karakteristisk DNA-strekning: en lang, gjentatt rekke som forfatterne kalte en TIGR-rekke (for Tandem Interspaced Guide RNA). De kalte proteinene Tas (TIGR-associated). Noen Tas-proteiner består bare av den nakne RNA-gripende delen; andre har et DNA-klippende verktøy — en av to typer molekylære sakser (kalt RuvC eller HNH) — festet på.

Etter å ha funnet familien i databasen tok de den så inn i laboratoriet: De uttrykte systemene i E. coli og sekvenserte de små RNA-ene de dannet, fant ut hvilke regler disse RNA-ene følger for å finne et DNA-mål, testet om de klippende variantene faktisk klippet, forsøkte å programmere en av dem til å redigere menneskeceller og frøs til slutt et fungerende kompleks og avbildet strukturen med nær-atomær oppløsning.

Hva de fant

Guiden består av to deler. TIGR-rekken prosesseres til korte RNA-er på rundt 36 bokstaver, som hver har to separate målrettingssegmenter. Ett segment leser den ene tråden i mål-DNA-et; det andre leser den motsatte tråden. De to arbeider sammen for å låse seg til et sted. Dette er et reelt mekanistisk brudd med CRISPR, der guiden passer til én enkelt tråd i én sammenhengende strekning.

Og det trenger ingen “landingsplass”. Mange CRISPR-nukleaser kan bare klippe ved siden av et kort, spesifikt DNA-motiv (et “PAM”) som ligger inntil målet — en begrensning som innskrenker hvor de kan rettes. TIGR-systemene viste ikke noe slikt krav: De baserte seg bare på målsekvensen. Et system som ikke trenger et PAM, kan i prinsippet rettes mot flere steder.

De klippende variantene klipper, presist. Styrt av det lille RNA-et laget de RuvC- og HNH-bærende Tas-proteinene rene, sekvensspesifikke brudd i DNA — og gjorde ingenting uten guiden.

Én variant kunne programmeres til å redigere menneskeceller — så vidt. Da et Tas-protein ble flyttet inn i menneskeceller i en skål og rettet mot seks forskjellige gener, laget det faktisk redigeringer, noe som bekrefter at systemet også kan programmeres i cellene våre. Men effektiviteten var lav: i beste fall noen få prosent av cellene. Til sammenligning redigerer dagens optimaliserte CRISPR-verktøy rutinemessig en stor andel av cellene de settes inn i. Dette er et bevis på at det kan virke, ikke et verktøy som virker godt.

Strukturen forklarte mekanismen — og antydet opprinnelsen. Det avbildede komplekset er et speilsymmetrisk par av proteiner som griper rundt det åttetallsformede guide-RNA-et, med mål-DNA-et bøyd i en skarp sving. Påfallende nok ligner denne arkitekturen sterkt på en maskin som finnes hos slektninger av våre egne celler — boks C/D-“snoRNP”, som styrer kjemiske endringer av RNA i stedet for å klippe DNA.

Den naturlige oppgaven er uklar. Da forfatterne uttrykte ett system i E. coli, avverget det ikke invaderende virus eller plasmider — CRISPRs vanlige oppgave. I stedet fjernet det gradvis et målrettet plasmid over mange generasjoner, noe som antyder at den egentlige rollen kan ligge i langsom konkurranse mellom mobile DNA-biter snarere enn i immunforsvarets frontlinje. Men dette var et lånt, kunstig miljø, og det ærlige svaret er at ingen ennå vet hva disse systemene gjør i naturen.

Hva dette sannsynligvis betyr

To ting, med ulik grad av sikkerhet.

Det sikre: Den kjente verdenen av RNA-styrte systemer er større og mer variert enn CRISPR og systemets nylig oppdagede slektninger. TIGR-Tas er en virkelig egen gren, med sin egen todelte, PAM-frie måte å gjenkjenne DNA på. Det er et reelt tillegg til kartet.

Det dypere og mer spekulative: Fordi TIGR-maskineriet er bygget som snoRNP-et som redigerer RNA i celler som våre, og som et kjent “hoppende gen”, kan det markere en evolusjonær kobling mellom RNA-styrte systemer som modifiserer RNA og RNA-styrte systemer som målretter DNA — en mulig manglende brikke i historien om hvordan programmerbare RNA-guider oppsto på tvers av livet.

Hva dette ikke beviser

• Det er ikke et ferdig genredigeringsverktøy. Redigering i menneskeceller ble demonstrert, men var svak — i beste fall noen få prosent. Det er bevis på programmerbarhet, ikke en moden editor, og langt unna noe klinisk.
• Det er ikke “CRISPR 2.0”. Målt som verktøy i dag er CRISPR-Cas9 langt mer effektivt til å redigere. TIGR-Tas er en ny arkitektur på konseptbevisstadiet, ikke en bedre versjon av et eksisterende produkt.
• Den biologiske rollen er ukjent. Det virket ikke som et antiviralt immunsystem i den ene testen av denne ideen; “et nytt bakterielt immunsystem” er ikke dokumentert.
• Mye av den grunnleggende mekanismen er fortsatt uavklart — blant annet hvordan guide-RNA-et klippes til sin endelige lengde, og hva disse systemene faktisk retter seg mot i naturen (de fleste finnes i mikrober vi knapt kan dyrke).
• Det finnes ikke noe terapeutisk her. Dette er oppdagelse og karakterisering i mikrober og cellekultur — ingen sykdom, ingen behandling, ingen pasient.

Hvor sterke er bevisene?

Selve oppdagelsen står på trygg grunn og er uvanlig grundig underbygget: Den hviler på strukturell kartlegging i stor skala, deretter laboratoriebekreftelse av hvordan RNA-et dannes og hvordan det finner og klipper DNA, så en nær-atomær struktur av komplekset i arbeid, i tillegg til testen i menneskeceller. Påstanden “dette er en ny, særskilt familie av RNA-styrte systemer som målretter DNA” er godt støttet fra flere kanter samtidig.

Det som er på et tidlig stadium, er alt som gjelder nytteverdi: Redigeringen virker, men så vidt, og all optimaliseringen som gjorde CRISPR fra kuriositet til verktøy, ligger fortsatt foran TIGR. Og det som er slutningsbasert, er resten av historien — den naturlige rollen er en rimelig antakelse fra et kunstig eksperiment, og den evolusjonære koblingen er, selv om den er elegant, et argument basert på felles struktur, ikke en fastslått historie. Studien er nøye med å skille mellom disse tingene.

Hvorfor det er viktig

Flere tidligere utvidelser av katalogen over RNA-styrte systemer har etter hvert gitt resultater. Systemene bak dagens verktøy — Cas9, Cas12, Cas13 og, mer nylig, de mindre IscB/OMEGA-proteinene og de eukaryote Fanzor-proteinene — var alle i begynnelsen bare nybeskrevet biologi. Ingen av dem kom som et ferdig verktøy. Et system med en todelt guide og uten krav om PAM er et virkelig annerledes utgangspunkt, og PAM-fri målretting er nettopp den typen fleksibilitet verktøyutviklere verdsetter.

Men det stillere resultatet kan være viktigere enn utsiktene til et verktøy. Ved å knytte et DNA-klippende system til det RNA-redigerende snoRNP-maskineriet og til et hoppende gen skisserer arbeidet en mulig tråd som forbinder svært ulike RNA-styrte systemer på tvers av livets tre. Det er den typen funn som omorganiserer et fagfelts forståelse av hvor verktøyene kommer fra — noe som i det lange løp er mer verdt enn enda en overskrift om sakser.

Ren oppsummering

Ved å søke etter proteiners former i stedet for sekvenser oppdaget forskere TIGR-Tas: en tidligere ukjent familie av RNA-styrte systemer som målretter DNA, og som hovedsakelig finnes i bakterievirus og parasittiske bakterier. Guide-RNA-et er uvanlig — rundt 36 bokstaver med to separate målrettingssegmenter som leser motsatte DNA-tråder — og i motsetning til CRISPR trenger det ikke noe tilstøtende “PAM”-motiv. De DNA-klippende medlemmene klipper presist, ett av dem kunne programmeres til å redigere menneskeceller (men bare med noen få prosents effektivitet), og en nær-atomær struktur viste et kompleks bygget som snoRNP-maskineriet som redigerer RNA i våre egne celler — noe som antyder en dyp evolusjonær kobling mellom RNA-styrte systemer som modifiserer RNA, og systemer som målretter DNA. Det er en reell utvidelse av RNA-styrt biologi og et mulig nytt chassis for fremtidige verktøy — en grunnvitenskapelig oppdagelse og et konseptbevis, ikke en moden geneditor, ikke “CRISPR 2.0” og ikke en terapi. Den naturlige oppgaven i det fri er fortsatt ukjent.

Sjekk uten omsvøp

Hva studien viser: En ny, særskilt familie av RNA-styrte systemer som målretter DNA (TIGR-Tas) i prokaryoter og virusene deres, funnet gjennom strukturell kartlegging; et guide-RNA med to segmenter, uten PAM (~36 nt), som målretter begge DNA-trådene sammen; presis RNA-styrt DNA-kløyving utført av medlemmene som bærer nuklease; programmerbar redigering i menneskeceller med lav effektivitet (opptil noen få prosent); en nær-atomær cryo-EM-struktur; og strukturelle/evolusjonære koblinger til boks C/D-snoRNP-er og IS110-transposoner.

Hva som er plausibelt, men ikke bevist: Systemenes naturlige biologiske rolle (en annen rolle enn forsvar i konkurransen mellom mobile elementer antydes av ett kunstig eksperiment); den foreslåtte evolusjonære broen mellom RNA-modifiserende og DNA-målrettende RNA-styrte systemer (et strukturelt argument).

Hva den ikke viser: Et modent eller høyeffektivt genredigeringsverktøy; overlegenhet sammenlignet med CRISPR som verktøy; en bekreftet naturlig funksjon; hvordan guide-RNA-et modnes; noen terapeutisk anvendelse.

Hovedbegrensninger: Redigeringseffektiviteten i menneskeceller er lav (bare konseptbevis); de fleste systemene finnes i metagenomer som er vanskelige å studere, så de naturlige målene er i stor grad ukjente; påstandene om biologisk rolle og evolusjonært opphav er slutningsbaserte; karakteriseringen er gjort i mikrober og cellekultur, ikke i noen sykdomssammenheng.

Hvor stor tillit bør en vanlig leser ha? Høy tillit til at dette er en ekte, særskilt ny familie av RNA-styrte systemer som målretter DNA, med en ny todelt, PAM-fri mekanisme, og til at de strukturelle og evolusjonære innsiktene er reelle. Høy tillit til at det ikke er et ferdig genredigeringsverktøy, ikke “CRISPR 2.0” og ikke en terapi. Lav tillit når det gjelder den naturlige rollen og hvor langt det vil nå som verktøy. Passende holdning: ekte begeistring for ny biologi og en mulig manglende evolusjonær kobling — og tålmodighet med anvendelsene, som er helt i startfasen.