TIGR-Tas፦ ከCRISPR የተለየ፣ በRNA የሚመራ አዲስ የDNA ዒላማ ስርዓት

በRNA የሚመሩ ሞለኪውላዊ ማሽኖች ዛፍ ላይ አዲስ ቅርንጫፍ

አንዳንድ ጊዜ የባዮሎጂ ጥናት ራሱ ያልጠየቀውን አስደናቂ ርዕስ ይዞ ይመጣል። ለዚህ ጥናትም “አዲስ CRISPR” የሚል ስያሜ ተሰጥቶት ነበር። ከዚያ ርዕስ ጀርባ ያለው ሥራ ግን ይበልጥ አስደሳች ነው — እና እንደተለመደውም የተነገረውን ያህል ትልቅ የቴክኖሎጂ ዝላይ አይደለም።

CRISPR ታዋቂ ያደረገውን መሠረታዊ ሀሳብ እንጀምር፤ በRNA የሚመራ ስርዓት። ፕሮቲኑ አንድን ዒላማ ብቻ እንዲያውቅ ከመጀመሪያው በቋሚነት እንዲቀረጽ አያስፈልገውም። በምትኩ አጭር የRNA ቁራጭ — መሪ RNA — ይይዛል፣ እና የዚያ መሪ ቅደም ተከተል ከሚዛመድበት ቦታ ይሄዳል። መሪውን ቀይር፣ ዒላማውም ይቀየራል። CRISPR ወደ መሣሪያነት የተለወጠው በዚህ ፕሮግራም ሊደረግ በሚችል ባህሪው ምክንያት ነው። ነገር ግን CRISPR በተፈጥሮ ውስጥ ያለው ብቸኛ በRNA የሚመራ ስርዓት አይደለም። ይህ ጥናት የሚጠይቀው ቀላል ግን ጠቃሚ ጥያቄ ነው፤ ሌሎች ምን ዓይነት ስርዓቶች አሉ፣ እና ምን ሊያስተምሩን ይችላሉ?

እነዚህን ስርዓቶች ለመፈለግ ደራሲዎቹ ተመሳሳይ የጂን ቅደም ተከተሎችን አልፈለጉም፤ ቅደም ተከተሎች በዝግመተ ለውጥ ዘመን እጅግ ስለሚለዋወጡ ሩቅ ዘመዶችን ማግኘት አያስችሉም። በምትኩ ቅርጾችን ፈለጉ። የCRISPR Cas9 ፕሮቲን መሪ RNAውን የሚይዝበትን ክፍል መነሻ በማድረግ፣ ተመሳሳይ አወቃቀር ያላቸውን ፕሮቲኖች በተገመቱ የፕሮቲን መዋቅሮች ዳታቤዞች ውስጥ ፈለጉ። ይህ ፍለጋ — በባክቴሪያ “የሚዘል ጂን” እና መደበኛ ህዋሶች የራሳቸውን RNA በኬሚካል ለማሻሻል በሚጠቀሙበት ማሽነሪ በኩል — በእውነት አዲስ ወደሆነ ስርዓት አመራ።

ደራሲዎቹ ምን አደረጉ?

የመዋቅር ፍለጋው ከዚህ በፊት ያልታወቀ የፕሮቲን ቤተሰብ አገኘ። እነዚህ ፕሮቲኖች በአብዛኛው ባክቴሪያን በሚያጠቁ ቫይረሶች — bacteriophages — ውስጥ፣ በarchaea ቫይረሶች እና በእጅግ ትንንሽ ጥገኛ ባክቴሪያዎች ውስጥ ይመዘገባሉ። እያንዳንዳቸው ከተለየ የDNA ክፍል አጠገብ ይገኛሉ፤ ደራሲዎቹ TIGR array (Tandem Interspaced መመሪያ RNA) ብለው የሰየሙት ረጅም፣ ተደጋጋሚ ድርድር። ፕሮቲኖቹን Tas (TIGR-associated) ብለው ጠሩ። አንዳንድ Tas ፕሮቲኖች RNAን የሚይዘውን ክፍል ብቻ አላቸው፤ ሌሎች ደግሞ DNAን የሚቆርጥ ሞለኪውላዊ “መቀስ” — RuvC ወይም HNH — ተጨምሮባቸዋል።

ቤተሰቡን በዳታቤዝ ውስጥ ካገኙ በኋላ ወደ ላቦራቶሪ ወሰዱት። ስርዓቶቹን በE. coli ውስጥ እንዲገለጹ አደረጉ፣ የፈጠሯቸውን አጭር RNAs ቅደም ተከተል አነበቡ፣ እነዚህ RNAs የDNA ዒላማን በምን ደንብ እንደሚያገኙ መረመሩ፣ መቁረጫ ያላቸው እትሞች በእውነት እንደሚቆርጡ ፈተኑ፣ አንዱን በሰው ህዋሶች ውስጥ ለጂን አርትዖት ፕሮግራም ለማድረግ ሞከሩ፣ በመጨረሻም በሥራ ላይ ያለውን ኮምፕሌክስ በማቀዝቀዝ አወቃቀሩን ከአቶም ደረጃ በቅርብ የሚያሳይ ምስል አገኙ።

ምን አገኙ?

መሪው ሁለት የዒላማ ክፍሎች አሉት። TIGR array በግምት 36 ኒውክሊዮታይድ ርዝመት ያላቸው አጭር RNAs ይፈጥራል፤ እያንዳንዳቸውም ሁለት ተለያዩ የዒላማ መለያ ክፍሎችን ይይዛሉ። አንዱ የዒላማ DNAውን አንድ ክር ያነባል፣ ሁለተኛው ደግሞ ተቃራኒውን ክር ያነባል። ሁለቱ በአንድነት ቦታውን በትክክል ይወስናሉ። ይህ ከCRISPR ዘዴ የተለየ ነው፤ በCRISPR መሪው በአንድ ቀጣይ ቅደም ተከተል አንድ የDNA ክርን ብቻ ይዛመዳል።

ከዒላማው አጠገብ “የማረፊያ ምልክት” አያስፈልገውም። ብዙ CRISPR nucleases መቁረጥ የሚችሉት ከዒላማው ጎን አጭር የDNA ምልክት — PAM — ሲኖር ብቻ ነው። ይህም ሊያነጣጥሩባቸው የሚችሉ ቦታዎችን ይገድባል። TIGR ስርዓቶች እንዲህ ያለ መስፈርት አላሳዩም፤ በዒላማው ቅደም ተከተል ብቻ ተመርኩዘዋል። PAM የማያስፈልገው ስርዓት በመርህ ደረጃ ወደ ብዙ ተጨማሪ የDNA ቦታዎች ሊመራ ይችላል።

መቁረጫ ያላቸው እትሞች በትክክል ይቆርጣሉ። በአጭሩ RNA ሲመሩ፣ RuvC ወይም HNH ያላቸው Tas ፕሮቲኖች በቅደም ተከተል ተመርኩዘው ንጹህ የDNA መቆራረጦችን ፈጠሩ። መሪ RNAው ሳይኖር ግን አልቆረጡም።

አንድ እትም በሰው ህዋሶች ውስጥ ለአርትዖት ሊፕሮግራም ይችላል — ግን በጣም ደካማ ነው። በላቦራቶሪ የተዳበሩ የሰው ህዋሶች ውስጥ አስገብተው ወደ ስድስት የተለያዩ ጂኖች ሲመሩት፣ አንድ Tas ፕሮቲን አርትዖት ፈጠረ። ይህ ስርዓቱ በሰው ህዋሶችም ፕሮግራም ሊደረግ እንደሚችል ያሳያል። ውጤታማነቱ ግን ዝቅተኛ ነበር፤ በምርጥ ሁኔታ ከህዋሶቹ ጥቂት በመቶዎቹ ብቻ ተስተካከሉ። ዛሬ የተሻሻሉ CRISPR መሣሪያዎች ደግሞ ብዙ ከፍ ያለ የህዋስ ክፍልን በመደበኛነት ያርታያሉ። ስለዚህ ይህ “መሥራት ይችላል” የሚለውን ያረጋግጣል፤ “በጥሩ ሁኔታ ይሠራል” የሚል ዝግጁ መሣሪያ አያደርገውም።

መዋቅሩ ዘዴውን አብራራ — እና ስለ መነሻው ፍንጭ ሰጠ። በምስል የታየው ኮምፕሌክስ ስምንት-ቅርጽ ያለውን መሪ RNA የሚይዙ እርስ በርስ የሚያንጸባርቁ ሁለት ፕሮቲኖችን ያካትታል፣ ዒላማ DNAውም በጠንካራ ማዕዘን ተጣጥፎ ያልፋል። በተለይ አስደናቂው ነገር ይህ አወቃቀር በእኛ ዘመድ የሆኑ ህዋሶች ውስጥ ካለው box C/D snoRNP ማሽነሪ ጋር በጣም መመሳሰሉ ነው። snoRNP DNAን አይቆርጥም፤ RNA ላይ የኬሚካል ማሻሻያዎችን ይመራል።

በተፈጥሮ ውስጥ የሚሠራው ሥራ ገና አይታወቅም። ደራሲዎቹ አንድ ስርዓት በE. coli ውስጥ እንዲገለጽ ሲያደርጉት፣ እንደ CRISPR የሚገቡ ቫይረሶችን ወይም plasmidsን አልከላከለም። በምትኩ በብዙ ትውልዶች ሂደት ዒላማ የሆነውን plasmid ቀስ በቀስ ከህዋሶቹ አስወገደ። ይህ እውነተኛ ሚናው የፊት-መስመር የኢሚውን መከላከያ ሳይሆን በተንቀሳቃሽ የDNA አባላት መካከል በሚፈጠር ቀስ ያለ ውድድር ውስጥ ሊሆን እንደሚችል ይጠቁማል። ነገር ግን ይህ የተፈተነው በሰው ሠራሽ፣ ከተፈጥሯዊ አውዱ ውጭ ባለ ስርዓት ውስጥ ነው። እውነተኛው መልስ እስካሁን ድረስ እነዚህ ስርዓቶች በተፈጥሮ ምን እንደሚሠሩ ማንም አያውቅም የሚለው ነው።

ይህ ምናልባት ምን ማለት ነው?

ሁለት ነገሮች አሉ፣ ግን የማረጋገጫ ደረጃቸው የተለያየ ነው።

ጠንካራው ውጤት፤ በRNA የሚመሩ ስርዓቶች የታወቀው ዓለም CRISPRን እና በቅርቡ የተገኙ ዘመዶቹን ብቻ ከሚያካትት የበለጠ ሰፊ እና የተለያየ ነው። TIGR-Tas ሁለት-ክፍል መሪ እና PAM-ነጻ የDNA ማወቂያ ዘዴ ያለው በእውነት የተለየ ቅርንጫፍ ነው። ይህ በታወቀው ካርታ ላይ እውነተኛ አዲስ ነገር ነው።

የበለጠ ጥልቅ ነገር ግን በግምት ላይ የተመሠረተ ነው፤ TIGR ማሽነሪ በእኛ ዓይነት ህዋሶች ውስጥ RNAን ከሚያሻሽለው snoRNP እና ከታወቀ “የሚዘል ጂን” ጋር ተመሳሳይ ስለሆነ፣ በRNA የሚመሩ RNA-ማሻሻያ ስርዓቶች እና በRNA የሚመሩ DNA-ዒላማ ስርዓቶች መካከል የዝግመተ ለውጥ ግንኙነት ሊያመለክት ይችላል። ይህ ፕሮግራም ሊደረጉ የሚችሉ RNA መሪዎች በሕይወት ዛፍ ላይ እንዴት እንደተፈጠሩ ታሪክ ውስጥ የጎደለ ክፍል ሊሆን ይችላል።

ይህ ጥናት የማያረጋግጠው

• ለመጠቀም ዝግጁ የጂን አርትዖት መሣሪያ አይደለም። በሰው ህዋሶች ውስጥ አርትዖት ታይቷል፣ ግን በጣም ደካማ ነው — በምርጥ ሁኔታ ጥቂት በመቶ ብቻ። ይህ ፕሮግራም ሊደረግ እንደሚችል ማስረጃ ነው፣ የበሰለ አርታዒ አይደለም፣ ከክሊኒካዊ አጠቃቀምም በጣም ሩቅ ነው።
• “CRISPR 2.0” አይደለም። ዛሬ እንደ መሣሪያ ሲነጻጸር CRISPR-Cas9 እጅግ የበለጠ ውጤታማ ነው። TIGR-Tas በማረጋገጫ-of-concept ደረጃ ያለ አዲስ አወቃቀር ነው፣ ያለውን መሣሪያ የሚተካ የተሻለ ምርት አይደለም።
• ተፈጥሯዊ ባዮሎጂያዊ ሚናው አይታወቅም። የፀረ-ቫይረስ ኢሚውን ስርዓት መሆኑን በተፈተነበት አንድ ሙከራ እንደዚያ አልሠራም፤ “አዲስ የባክቴሪያ ኢሚውን ስርዓት” የሚል መደምደሚያ አልተረጋገጠም።
• ከመሠረታዊ ዘዴው ብዙ ነገር ገና ክፍት ጥያቄ ነው — መሪ RNAው ወደ መጨረሻው ርዝመት እንዴት እንደሚቆረጥ፣ እና እነዚህ ስርዓቶች በተፈጥሮ በእውነት ምንን እንደሚያነጣጥሩ ጨምሮ። አብዛኞቹ ለማዳበር እጅግ አስቸጋሪ በሆኑ ማይክሮቦች ውስጥ ይገኛሉ።
• የሕክምና ውጤት የለም። ይህ በማይክሮቦች እና በህዋስ ባህል ውስጥ የተደረገ ግኝትና መግለጫ ነው — በሽታ፣ ሕክምና ወይም ታካሚ አልተመረመረም።

ማስረጃው ምን ያህል ጠንካራ ነው?

ግኝቱ ራሱ ጠንካራ መሠረት ላይ ነው፣ እና ከብዙ አቅጣጫዎች ተረጋግጧል። ትልቅ የመዋቅር ዳታ ፍለጋ፣ RNAው እንዴት እንደሚፈጠር እና DNAን እንዴት እንደሚያገኝና እንደሚቆርጥ የላቦራቶሪ ማረጋገጫ፣ በሥራ ላይ ያለውን ኮምፕሌክስ የሚያሳይ ከአቶም ደረጃ በቅርብ የሆነ መዋቅር፣ እንዲሁም የሰው-ህዋስ ሙከራ አሉ። “ይህ አዲስና የተለየ በRNA የሚመራ DNA-ዒላማ ቤተሰብ ነው” የሚለው ዋና አባባል በብዙ ነጻ መስመሮች በጥሩ ሁኔታ ተደግፏል።

ገና በመጀመሪያ ደረጃ ያለው ነገር ሁሉ ከአጠቃቀሙ ጋር የተያያዘ ነው። አርትዖቱ ይሠራል፣ ግን በጣም ትንሽ፤ CRISPRን ከባዮሎጂያዊ ጉጉት ወደ ጠንካራ መሣሪያ የለወጠው ረጅም የማሻሻያ ሂደት ለTIGR ገና ከፊት ነው። ቀሪው ታሪክ ደግሞ ትርጓሜ እና ግምት ይዟል፤ ተፈጥሯዊ ሚናው በሰው ሠራሽ ሙከራ ላይ የተመሠረተ ምክንያታዊ ግምት ነው፣ የዝግመተ ለውጥ ግንኙነቱም ምንም እንኳ ውብ ሀሳብ ቢሆን በተመሳሳይ መዋቅር ላይ የተመሠረተ ክርክር ነው፣ የተዘጋ ታሪክ አይደለም። ጥናቱ እነዚህን ደረጃዎች በጥንቃቄ ይለያል።

ለምን ይጠቅማል?

ከዚህ በፊት በRNA የሚመሩ ስርዓቶች ዝርዝር በተስፋፋ ጊዜ አንዳንዶቹ በኋላ ጠቃሚ መሣሪያዎችን አፍርተዋል። የዛሬ መሣሪያዎች መሠረት የሆኑ Cas9፣ Cas12፣ Cas13፣ በቅርቡ የተገኙት ትንንሽ IscB/OMEGA ፕሮቲኖች እና በeukaryotes የሚገኙ Fanzors በመጀመሪያ ሲገለጹ አዲስ ባዮሎጂ ብቻ ነበሩ። አንዳቸውም እንደ ተጠናቀቀ መሣሪያ አልመጡም። ሁለት-ክፍል መሪ ያለው እና PAM የማያስፈልገው ስርዓት ከመጀመሪያው የተለየ መነሻ ነው፤ PAM-ነጻ ዒላማ ማድረግም መሣሪያ የሚገነቡ ሰዎች በጣም የሚፈልጉት ተለዋዋጭነት ነው።

ነገር ግን ከመሣሪያ ተስፋው ይልቅ ጸጥ ያለው ውጤት ረጅም ጊዜ የበለጠ አስፈላጊ ሊሆን ይችላል። DNAን የሚቆርጥ ስርዓትን ከRNA-አርትዖት snoRNP ማሽነሪ እና ከ“ሚዘል ጂን” ጋር በመያያዝ፣ ጥናቱ በሕይወት ዛፍ ላይ በጣም የተለያዩ በRNA የሚመሩ ስርዓቶችን ሊያገናኝ የሚችል የዝግመተ ለውጥ መስመር ይጠቁማል። አንድ መስክ መሣሪያዎቹ ከየት እንደመጡ የሚያስብበትን መንገድ የሚያደራጅ ዓይነት ግኝት ነው። በረጅም ጊዜ ይህ ስለ “አዲስ መቀስ” ከሚጻፍ ሌላ አስደናቂ ርዕስ የበለጠ ዋጋ ሊኖረው ይችላል።

ንጹህ ማጠቃለያ

ተመራማሪዎች የፕሮቲን ቅደም ተከተሎችን ሳይሆን ቅርጾችን በመፈለግ TIGR-Tas የተባለ ከዚህ በፊት ያልታወቀ በRNA የሚመራ DNA-ዒላማ ስርዓቶች ቤተሰብ አገኙ። በአብዛኛው በባክቴሪያ ቫይረሶች እና በጥገኛ ባክቴሪያዎች ይገኛል። መሪ RNAው ያልተለመደ ነው፤ በግምት 36 ኒውክሊዮታይዶች ያሉት ሲሆን ተቃራኒ የDNA ክሮችን የሚያነቡ ሁለት የዒላማ ክፍሎችን ይይዛል። ከCRISPR በተለየ መልኩ ከዒላማው አጠገብ PAM ምልክት አያስፈልገውም። DNA-መቁረጫ ያላቸው አባላት በትክክል ቆረጡ፣ አንዱም በሰው ህዋሶች ውስጥ ፕሮግራም ተደርጎ አርትዖት አደረገ — ግን ውጤታማነቱ ጥቂት በመቶ ብቻ ነበር። ከአቶም ደረጃ በቅርብ ያለ መዋቅሩ ደግሞ በእኛ ህዋሶች ዘመዶች ውስጥ RNAን ከሚያሻሽለው snoRNP ማሽነሪ ጋር የሚመሳሰል ኮምፕሌክስ አሳየ፣ ይህም በRNA የሚመሩ RNA-ማሻሻያ እና DNA-ዒላማ ስርዓቶች መካከል ጥልቅ የዝግመተ ለውጥ ግንኙነት ሊኖር እንደሚችል ይጠቁማል። ይህ የRNA-guided biologyን በእውነት የሚያሰፋ መሠረታዊ ግኝት እና ማረጋገጫ of concept ነው — የበሰለ የጂን አርታዒ አይደለም፣ “CRISPR 2.0” አይደለም፣ ሕክምናም አይደለም። በተፈጥሮ ውስጥ እውነተኛ ሚናው ገና አይታወቅም።

ያለ ማጋነን ማረጋገጫ

ጥናቱ የሚያሳየው: በመዋቅር ፍለጋ የተገኘ አዲስና የተለየ በRNA የሚመራ DNA-ዒላማ ስርዓቶች ቤተሰብ (TIGR-Tas) በprokaryotes እና በቫይረሶቻቸው ውስጥ፤ ሁለቱንም የDNA ክሮች በአንድነት የሚያነጣጥር ሁለት-ክፍል፣ PAM-ነጻ መሪ RNA (~36 nt)፤ nuclease ያላቸው አባላት በRNA ተመርተው በትክክል DNAን መቁረጥ፤ በሰው ህዋሶች ውስጥ በዝቅተኛ ውጤታማነት — እስከ ጥቂት በመቶ — ፕሮግራም ሊደረግ የሚችል አርትዖት፤ ከአቶም ደረጃ በቅርብ የሆነ cryo-EM መዋቅር፤ እና ከbox C/D snoRNPs እና IS110 transposons ጋር የመዋቅር/ዝግመተ ለውጥ ግንኙነቶች።

ምክንያታዊ ግን ያልተረጋገጠ: የስርዓቶቹ ተፈጥሯዊ ባዮሎጂያዊ ሚና — አንድ ሰው ሠራሽ ሙከራ በተንቀሳቃሽ የDNA አባላት ውድድር ውስጥ ከመከላከያ ውጭ ሚና ሊኖራቸው እንደሚችል ይጠቁማል፤ እና በRNA የሚመሩ RNA-ማሻሻያ እና DNA-ዒላማ ስርዓቶች መካከል የተጠቆመው የዝግመተ ለውጥ ድልድይ — በመዋቅር ላይ የተመሠረተ ክርክር።

የማያሳየው: የበሰለ ወይም ከፍተኛ-ውጤታማ የጂን አርትዖት መሣሪያ፤ ከCRISPR እንደ መሣሪያ የበለጠ መሆን፤ የተረጋገጠ ተፈጥሯዊ ተግባር፤ መሪ RNAው እንዴት ወደ መጨረሻው ቅርጽ እንደሚደርስ፤ ወይም ማንኛውም የሕክምና አጠቃቀም።

ዋና ገደቦች: በሰው ህዋስ ውስጥ የአርትዖት ውጤታማነት ዝቅተኛ ነው (ማረጋገጫ of concept ብቻ)፤ አብዛኞቹ ስርዓቶች ለማጥናት አስቸጋሪ በሆኑ metagenomes ውስጥ ስለሚገኙ ተፈጥሯዊ ዒላማዎቻቸው በአብዛኛው አይታወቁም፤ ስለ ባዮሎጂያዊ ሚና እና ስለ ዝግመተ ለውጥ መነሻ የተሰጡት ሀሳቦች በትርጓሜ ላይ የተመሠረቱ ናቸው፤ ምርመራው በማይክሮቦች እና በህዋስ ባህል ውስጥ ነው፣ በበሽታ አውድ ውስጥ አይደለም።

አጠቃላይ አንባቢ ምን ያህል እምነት ሊኖረው ይገባል? ይህ አዲስ፣ የተለየ፣ ሁለት-ክፍል እና PAM-ነጻ ዘዴ ያለው በRNA የሚመራ DNA-ዒላማ ስርዓት ቤተሰብ መሆኑ ላይ ከፍተኛ እምነት ሊኖር ይችላል፤ የመዋቅርና የዝግመተ ለውጥ ፍንጮቹም እውነተኛ ናቸው። ዝግጁ የጂን አርትዖት መሣሪያ፣ “CRISPR 2.0” ወይም ሕክምና አለመሆኑ ላይም ከፍተኛ እምነት ሊኖር ይገባል። ተፈጥሯዊ ሚናው እና ወደፊት እንደ መሣሪያ ምን ያህል እንደሚጠቅም ግን እርግጠኝነቱ ዝቅተኛ ነው። ተገቢው አቋም፤ ስለ አዲስ ባዮሎጂ እና ምናልባት ስለሚሞላ የዝግመተ ለውጥ ክፍተት እውነተኛ ጉጉት — እና ስለ አጠቃቀሙ ትዕግሥት፣ ምክንያቱም ገና መጀመሪያ ላይ ነው።