Новое семейство РНК-направляемых систем нацеливания на ДНК — отличное от CRISPR и пока не инструмент редактирования генов

Новая ветвь на дереве РНК-направляемых машин

Время от времени выходит биологическая статья, которой приписывают заголовок, о котором она никогда не просила. На этот раз это было «новый CRISPR». Работа за этим заголовком интереснее — и, как обычно, скромнее.

Начнем с того, чем прославился CRISPR: с РНК-направляемой системы. Ее хитрость в том, что белок не обязан быть жестко «запрограммирован» на распознавание одной мишени. Вместо этого он несет короткий фрагмент РНК — гид — и направляется туда, где последовательность этого гида совпадает с мишенью. Измените гид — изменится и мишень. Именно эта программируемость превратила CRISPR в инструмент. Но CRISPR — не единственная РНК-направляемая система в природе, и эта работа задает терпеливый вопрос: сколько других типов таких систем существует и чему они могут нас научить?

Чтобы искать такие системы, авторы не пытались находить похожие генные последовательности — за эволюционное время они меняются слишком сильно, чтобы по ним уверенно распознавать дальних родственников. Они искали формы. Взяв за отправную точку часть белка Cas9 системы CRISPR, удерживающую гидовую РНК, исследователи прочесали базы предсказанных белковых структур в поисках чего-то, построенного похожим образом. Этот след — через бактериальный «прыгающий ген» и механизм, которым обычные клетки химически модифицируют собственную РНК, — привел к действительно новому объекту.

Что сделали авторы

Структурный поиск выявил ранее нераспознанное семейство белков, кодируемых преимущественно бактериофагами (вирусами, заражающими бактерии), вирусами архей и крошечными паразитическими бактериями. Рядом с каждым таким геном находится характерный участок ДНК: длинный повторяющийся массив, который авторы назвали массивом TIGR (Tandem Interspaced Guide RNA). Сами белки они назвали Tas (TIGR-associated). Некоторые белки Tas — лишь «зажим» для РНК; к другим присоединен инструмент для разрезания ДНК — один из двух типов молекулярных ножниц, RuvC или HNH.

Найдя это семейство в базах данных, исследователи перенесли его в лабораторию: экспрессировали системы в E. coli и секвенировали образующиеся малые РНК, выяснили правила, по которым эти РНК находят мишень в ДНК, проверили, действительно ли варианты с нуклеазами режут ДНК, попытались запрограммировать один из них для редактирования человеческих клеток, а в конце заморозили работающий комплекс и определили его структуру с почти атомным разрешением.

Что они обнаружили

Гид состоит из двух частей. Массив TIGR обрабатывается в короткие РНК длиной примерно 36 нуклеотидов, каждая из которых содержит два отдельных направляющих сегмента. Один сегмент считывает одну цепь целевой ДНК, второй — противоположную. Вместе они фиксируют комплекс на нужном участке. Это реальное механистическое отличие от CRISPR, где гид соответствует одной цепи одним непрерывным участком.

И ему не нужна «посадочная площадка». Многие нуклеазы CRISPR могут резать только рядом с коротким специфическим мотивом ДНК («PAM»), расположенным возле мишени, — это ограничивает места, на которые их можно нацелить. Для систем TIGR такого требования не обнаружили: они полагались только на саму последовательность мишени. Систему, которой не нужен PAM, в принципе можно направлять на большее число участков.

Варианты с нуклеазами режут — и делают это точно. Направляемые малой РНК белки Tas с доменами RuvC или HNH создавали чистые, специфичные к последовательности разрывы ДНК — и ничего не делали без гида.

Один вариант удалось запрограммировать для редактирования человеческих клеток — едва-едва. Когда белок Tas перенесли в человеческие клетки в культуре и нацелили на шесть разных генов, он действительно внес изменения, подтвердив, что систему можно программировать и в наших клетках. Но эффективность была низкой: в лучшем случае редактировались несколько процентов клеток. Для сравнения, современные оптимизированные инструменты CRISPR обычно редактируют большую долю клеток, в которые их вводят. Это доказательство того, что система может работать, а не инструмент, который работает хорошо.

Структура объяснила механизм — и намекнула на происхождение. Визуализированный комплекс состоит из зеркально-симметричной пары белков, охватывающих гидовую РНК в форме восьмерки, тогда как целевая ДНК проходит через комплекс с резким изгибом. Примечательно, что эта архитектура очень напоминает механизм в клетках родственных нам организмов — box C/D snoRNP, который направляет химические модификации РНК, а не разрезает ДНК.

Ее естественная работа непонятна. Когда авторы экспрессировали одну из систем в E. coli, она не защищала клетки от чужих вирусов или плазмид — то есть не выполняла обычную работу CRISPR. Вместо этого на протяжении многих поколений она постепенно вытесняла плазмиду, на которую была нацелена. Это намекает, что ее настоящая роль может быть связана с медленной конкуренцией между мобильными элементами ДНК, а не с первой линией иммунной защиты. Но это был искусственный эксперимент в заимствованном клеточном контексте, поэтому честный ответ таков: пока никто не знает, что эти системы делают в природе.

Что это, вероятно, означает

Две вещи — с разным уровнем уверенности.

Первая, надежная: известный мир РНК-направляемых систем больше и разнообразнее, чем CRISPR и его недавно найденные родственники. TIGR-Tas — действительно отдельная ветвь со своим двухкомпонентным, независимым от PAM способом распознавания ДНК. Это настоящее дополнение к карте.

Вторая, более глубокая и спекулятивная: поскольку механизм TIGR устроен подобно snoRNP, модифицирующему РНК в клетках вроде наших, и подобно известному «прыгающему гену», он может обозначать эволюционную связь между РНК-направляемыми системами, ориентированными на модификацию РНК, и РНК-направляемыми системами, ориентированными на ДНК, — возможно, это недостающее звено в истории появления программируемых РНК-гидов в разных формах жизни.

Чего это не доказывает

• Это не готовый инструмент редактирования генов. Редактирование человеческих клеток продемонстрировали, но оно было слабым — в лучшем случае несколько процентов. Это доказательство программируемости, а не зрелый редактор, и до клинического применения очень далеко.
• Это не «CRISPR 2.0». Если оценивать их как инструменты сегодня, CRISPR-Cas9 редактирует несравнимо эффективнее. TIGR-Tas — новая архитектура на стадии проверки концепции, а не улучшенная версия готового продукта.
• Ее биологическая роль неизвестна. В одном тесте этой идеи система не вела себя как противовирусный иммунный механизм; утверждение о «новой бактериальной иммунной системе» не подтверждено.
• Многие детали базового механизма остаются открытыми — в том числе как гидовая РНК обрезается до окончательной длины и на что эти системы в действительности нацеливаются в природе (большинство из них происходит из микробов, которые мы почти не умеем культивировать).
• Здесь нет ничего терапевтического. Это открытие и характеристика систем в микробах и клеточной культуре — без болезни, лечения или пациентов.

Насколько сильны доказательства?

Само открытие стоит на прочном фундаменте и исследовано необычно разносторонне: оно опирается на масштабный структурный поиск, лабораторное подтверждение того, как образуется РНК и как она находит и разрезает ДНК, структуру активного комплекса с почти атомным разрешением, а также тест в человеческих клетках. Утверждение «это новое, отдельное семейство РНК-направляемых систем нацеливания на ДНК» поддерживается сразу несколькими независимыми линиями доказательств.

Ранним остается все, что касается полезности: редактирование работает, но едва, и вся оптимизация, превратившая CRISPR из биологической диковинки в инструмент, для TIGR еще впереди. А выводной остается остальная история: естественная роль — обоснованное предположение из одного искусственного эксперимента, а эволюционная связь, хотя и элегантная, — аргумент по общей структуре, а не установленная история. Статья аккуратно различает эти уровни уверенности.

Почему это важно

Несколько предыдущих расширений каталога РНК-направляемых систем в итоге дали практические плоды. Системы, лежащие в основе современных инструментов — Cas9, Cas12, Cas13, а недавно также меньшие белки IscB/OMEGA и эукариотические Fanzor, — поначалу были просто только что описанной биологией. Ни одна из них не появилась как готовый инструмент. Система с двухкомпонентным гидом и без требования PAM — действительно другая отправная точка, а возможность нацеливаться без PAM — именно тот вид гибкости, который ценят разработчики молекулярных инструментов.

Но более тихий результат может оказаться важнее перспективы нового инструмента. Связывая систему, разрезающую ДНК, с snoRNP-механизмом модификации РНК и с «прыгающим геном», работа намечает возможную нить, соединяющую очень разные РНК-направляемые системы на дереве жизни. Такие находки перестраивают представление целой области о происхождении ее инструментов — и в долгой перспективе это ценнее еще одного громкого заголовка о молекулярных ножницах.

Краткий итог

Ища не похожие последовательности, а формы белков, исследователи открыли TIGR-Tas — ранее неизвестное семейство РНК-направляемых систем нацеливания на ДНК, встречающееся преимущественно у вирусов бактерий и паразитических бактерий. Его гидовая РНК необычна: примерно 36 нуклеотидов с двумя отдельными направляющими сегментами, считывающими противоположные цепи ДНК; в отличие от CRISPR ей не нужен соседний мотив «PAM». Представители с нуклеазами точно разрезают ДНК, один из них удалось запрограммировать для редактирования человеческих клеток (хотя с эффективностью всего несколько процентов), а структура с почти атомным разрешением показала комплекс, устроенный подобно snoRNP-механизму, модифицирующему РНК в наших клетках, — это намекает на глубокую эволюционную связь между РНК-направляемыми системами модификации РНК и системами нацеливания на ДНК. Это настоящее расширение известной биологии РНК-направляемых систем и возможное новое шасси для будущих инструментов — фундаментальное открытие и проверка концепции, не зрелый редактор генов, не «CRISPR 2.0» и не терапия. Его естественная роль в природе остается неизвестной.

Проверка без преувеличений

Что показывает статья: Новое, отдельное семейство РНК-направляемых систем нацеливания на ДНК (TIGR-Tas) у прокариот и их вирусов, найденное с помощью структурного поиска; двухсегментную гидовую РНК без требования PAM (~36 нт), которая последовательно нацеливается на обе цепи ДНК; точное РНК-направляемое расщепление ДНК представителями с нуклеазами; программируемое редактирование человеческих клеток с низкой эффективностью (до нескольких процентов); крио-ЭМ-структуру с почти атомным разрешением; а также структурные и эволюционные связи с box C/D snoRNP и транспозонами IS110.

Что правдоподобно, но не доказано: Естественная биологическая роль этих систем (один искусственный эксперимент намекает на неиммунную роль в конкуренции мобильных элементов); предложенный эволюционный мост между РНК-направляемыми системами модификации РНК и нацеливания на ДНК (аргумент по структуре).

Чего работа не показывает: Зрелого или высокоэффективного инструмента редактирования генов; преимущества над CRISPR как инструментом; подтвержденной естественной функции; механизма созревания гидовой РНК; какого-либо терапевтического применения.

Основные ограничения: Эффективность редактирования человеческих клеток низка (только проверка концепции); большинство систем происходит из труднодоступных для исследования метагеномов, поэтому их естественные мишени в основном неизвестны; утверждения о биологической роли и эволюционном происхождении имеют выводной характер; характеристика проведена в микробах и клеточной культуре, а не в контексте какого-либо заболевания.

Сколько доверия стоит иметь обычному читателю? Высокое к тому, что это действительно новое, отдельное семейство РНК-направляемых систем нацеливания на ДНК с новым двухкомпонентным, независимым от PAM механизмом и что структурные и эволюционные наблюдения реальны. Столь же высокое к тому, что это не готовый инструмент редактирования генов, не «CRISPR 2.0» и не терапия. Низкое — к его естественной роли и к тому, насколько далеко оно зайдет как инструмент. Самая уместная позиция: искренний интерес к новой биологии и возможному недостающему эволюционному звену — и терпение в отношении применений, которые только начинаются.