RNT ilə yönləndirilən DNT-hədəfləyici sistemlərin yeni ailəsi — CRISPR-dən fərqlidir və hələ gen redaktə aləti deyil

RNT ilə yönləndirilən maşınlar ağacında yeni budaq

Arabir biologiya məqaləsi özünün heç istəmədiyi bir başlıqla gündəmə gəlir. Bu dəfə həmin başlıq “yeni CRISPR” idi. Arxasındakı iş bundan daha maraqlıdır — və həmişə olduğu kimi, daha təvazökar nəticə verir.

CRISPR-in məşhurlaşdırdığı anlayışdan başlayaq: RNT ilə yönləndirilən sistem. Burada zülalın yalnız bir hədəfi tanımaq üçün əvvəlcədən “sabitləşdirilməsi” lazım deyil. Əvəzində o, qısa bir RNT parçası — bələdçi — daşıyır və həmin bələdçinin ardıcıllığının uyğun gəldiyi yerə gedir. Bələdçini dəyişin, hədəf də dəyişir. Məhz bu proqramlaşdırıla bilmə xüsusiyyəti CRISPR-i alətə çevirdi. Amma təbiətdə RNT ilə yönləndirilən yeganə sistem CRISPR deyil və bu məqalənin verdiyi sual səbirli bir sualdır: başqa neçə növ belə sistem var və onlar bizə nə öyrədə bilər?

Onları axtarmaq üçün müəlliflər uyğun gen ardıcıllıqları axtarmadılar — təkamül zamanı bu ardıcıllıqlar uzaq qohumları tanımağa imkan verməyəcək qədər dəyişə bilir. Onlar formaları axtardılar. CRISPR-in Cas9 zülalında bələdçi RNT-ni tutan hissədən başlayaraq, proqnozlaşdırılmış zülal strukturları verilənlər bazalarında eyni quruluşa malik nələrinsə olub-olmadığını araşdırdılar. Bu iz onları — bakterial “sıçrayan gen” və adi hüceyrələrin öz RNT-lərini kimyəvi dəyişdirmək üçün istifadə etdiyi mexanizm vasitəsilə — həqiqətən yeni bir sistemə gətirdi.

Müəlliflər nə etdilər

Struktur axtarışı əvvəllər tanınmamış bir zülal ailəsini üzə çıxardı. Onlar əsasən bakteriofaqlarda (bakteriyaları yoluxduran viruslarda), arxeya viruslarında və çox kiçik parazit bakteriyalarda kodlanır. Hər birinin yanında fərqli bir DNT sahəsi yerləşir: müəlliflərin TIGR array (Tandem Interspaced Guide RNA) adlandırdığı uzun, təkrarlanan massiv. Zülallara isə Tas (TIGR-associated) adı verildi. Bəzi Tas zülalları yalnız RNT-ni tutan əsas hissədən ibarətdir; digərlərində isə iki növ molekulyar “qayçıdan” biri — RuvC və ya HNH — şəklində DNT-kəsən hissə əlavə olunub.

Ailəni verilənlər bazasında tapdıqdan sonra onu laboratoriyaya gətirdilər: sistemləri E. coli-də ifadə etdilər və yaranan kiçik RNT-ləri sekvens etdilər, həmin RNT-lərin DNT hədəfini hansı qaydalarla tapdığını müəyyənləşdirdilər, kəsici variantların həqiqətən kəsib-kəsmədiyini sınaqdan keçirdilər, onlardan birini insan hüceyrələrini redaktə etmək üçün proqramlaşdırmağa çalışdılar və sonda işləyən kompleksi donduraraq onun strukturunu atom səviyyəsinə yaxın ayırdetmə ilə görüntülədilər.

Nə tapdılar

Bələdçi iki hissədən ibarətdir. TIGR massivi təxminən 36 nukleotidlik qısa RNT-lərə emal olunur və onların hər biri iki ayrı hədəfləmə seqmenti daşıyır. Bir seqment hədəf DNT-nin bir zəncirini, digəri isə əks zənciri oxuyur. Bu iki hissə birlikdə işləyərək konkret sahəni sabitləşdirir. Bu, bələdçisi bir zəncirə fasiləsiz bir sahə boyunca uyğun gələn CRISPR-dən həqiqi mexanistik fərqdir.

Üstəlik, ona “eniş meydançası” lazım deyil. Bir çox CRISPR nukleazı yalnız hədəfin yanında qısa və xüsusi DNT motivi — “PAM” — olduqda kəsə bilir; bu da onların yönəldilə biləcəyi yerləri məhdudlaşdırır. TIGR sistemlərində belə tələb görünmədi: onlar yalnız hədəf ardıcıllığına əsaslanırdı. PAM tələb etməyən sistem, prinsipcə, daha çox mövqeyə yönəldilə bilər.

Kəsici variantlar dəqiq kəsir. Kiçik RNT-nin yönləndirməsi ilə RuvC və HNH daşıyan Tas zülalları DNT-də təmiz, ardıcıllığa-spesifik qırılmalar yaratdı — bələdçi olmadan isə heç nə etmədi.

Bir variant insan hüceyrələrini redaktə etmək üçün proqramlaşdırıla bildi — amma çox zəif. Petri qabında insan hüceyrələrinə köçürülərək altı müxtəlif genə yönəldilən Tas zülalı həqiqətən redaktələr yaratdı və sistemin bizim hüceyrələrimizdə də proqramlaşdırıla bildiyini göstərdi. Lakin səmərəlilik aşağı idi: ən yaxşı halda hüceyrələrin bir neçə faizi. Müqayisə üçün, bugünkü optimallaşdırılmış CRISPR alətləri adətən tətbiq olunduqları hüceyrələrin böyük hissəsini redaktə edir. Bu, sistemin işləyə bildiyini göstərən sübutdur, yaxşı işləyən alət deyil.

Struktur mexanizmi izah etdi — və mənşəyə dair ipucu verdi. Görüntülənən kompleks səkkizvari bələdçi RNT-ni qucaqlayan, güzgü simmetriyalı iki zülaldan ibarətdir; hədəf DNT isə kəskin şəkildə bükülür. Maraqlıdır ki, bu arxitektura bizim hüceyrələrimizin qohumlarında olan box C/D “snoRNP” maşınına çox bənzəyir. snoRNP DNT-ni kəsmir, RNT-yə kimyəvi dəyişikliklər yönləndirir.

Təbiətdəki işi aydın deyil. Müəlliflər sistemlərdən birini E. coli-də ifadə etdikdə, o, CRISPR-in adi işi olan virus və ya plazmid hücumundan müdafiə etmədi. Əvəzində, hədəflənən plazmidi çoxsaylı nəsillər ərzində tədricən populyasiyadan çıxardı. Bu, sistemin həqiqi rolunun ön cəbhə immun müdafiəsindən çox mobil DNT elementləri arasındakı yavaş rəqabətlə bağlı ola biləcəyinə işarə edir. Amma bu, sistem üçün yad və süni şərait idi; dürüst cavab budur ki, bu sistemlərin təbiətdə nə etdiyi hələ bilinmir.

Bu, yəqin ki, nə deməkdir

İki nəticə var və onların etibarlılıq səviyyəsi eyni deyil.

Möhkəm nəticə: məlum RNT-yönləndirilən sistemlər dünyası CRISPR və onun yaxınlarda tapılan qohumlarından daha böyük və müxtəlifdir. TIGR-Tas DNT-ni tanımaq üçün özünəməxsus iki hissəli, PAM-sız mexanizmə malik həqiqətən ayrı bir budaqdır. Bu, xəritəyə real əlavədır.

Daha dərin, amma daha spekulyativ nəticə: TIGR mexanizmi bizim hüceyrələrimizə bənzər hüceyrələrdə RNT-ni redaktə edən snoRNP kimi və məlum bir “sıçrayan gen” mexanizmi kimi qurulduğuna görə, o, RNT ilə yönləndirilən RNT-dəyişdirici sistemlərlə RNT ilə yönləndirilən DNT-hədəfləyici sistemlər arasında təkamül əlaqəsini göstərə bilər — proqramlaşdırıla bilən RNT bələdçilərinin həyat ağacında necə yarandığı tarixində mümkün itkin halqa.

Bu nəyi sübut etmir

• Bu, hazır gen redaktə aləti deyil. İnsan hüceyrələrində redaktə göstərildi, amma zəif idi — ən yaxşı halda bir neçə faiz. Bu, proqramlaşdırıla bilmənin sübutudur, yetkin redaktor deyil və klinik tətbiqdən çox uzaqdır.
• Bu, “CRISPR 2.0” deyil. Bu gün alət kimi müqayisə ediləndə CRISPR-Cas9 ondan qat-qat səmərəli redaktə edir. TIGR-Tas mövcud məhsulun daha yaxşı versiyası deyil, konsepsiya-sübutu mərhələsində yeni arxitekturadır.
• Onun bioloji rolu məlum deyil. Bu fikir bir dəfə sınaqdan keçiriləndə o, antivirus immun sistemi kimi işləmədi; “yeni bakterial immun sistemi” nəticəsi müəyyənləşdirilməyib.
• Əsas mexanizmin xeyli hissəsi hələ açıqdır — o cümlədən bələdçi RNT-nin son uzunluğuna necə kəsildiyi və bu sistemlərin təbiətdə əslində nəyi hədəflədiyi (çoxu laboratoriyada demək olar ki, yetişdirə bilmədiyimiz mikroblarda yaşayır).
• Burada terapevtik nəticə yoxdur. Bu, mikroblarda və hüceyrə kulturasında aparılan kəşf və xarakterizasiya işidir — xəstəlik, müalicə və pasiyent yoxdur.

Sübut nə qədər güclüdür?

Kəşfin özü möhkəm əsasdadır və qeyri-adi dərəcədə çoxşaxəli təsdiqlənib: böyükmiqyaslı struktur axtarışına, sonra RNT-nin necə yarandığının və DNT-ni necə tapıb kəsdiyinin laboratoriya təsdiqinə, işləyən kompleksin atom səviyyəsinə yaxın strukturuna və insan hüceyrəsi sınağına söykənir. “Bu, yeni, ayrı, RNT ilə yönləndirilən DNT-hədəfləyici ailədir” iddiası bir neçə müstəqil istiqamətdən yaxşı dəstəklənir.

Erkən olan hissə onun faydalılığı ilə bağlı hər şeydir: redaktə işləyir, amma çox zəif; CRISPR-i maraqlı bioloji sistemdən alətə çevirən bütün optimallaşdırma TIGR üçün hələ qarşıdadır. Nəticə çıxarmağa əsaslanan hissə isə hekayənin qalanıdır — təbii rola dair fikir süni təcrübədən çıxan məntiqli ehtimaldır, təkamül əlaqəsi isə cəlbedici olsa da, ortaq struktura söykənən arqumentdir, təsdiqlənmiş tarix deyil. Məqalə bunların sərhədini diqqətlə qoruyur.

Niyə vacibdir

RNT-yönləndirilən sistemlər kataloqunun əvvəlki genişlənmələrinin bir neçəsi sonda faydalı olub. Bugünkü alətlərin arxasındakı sistemlər — Cas9, Cas12, Cas13 və daha yaxın vaxtlarda tapılmış daha kiçik IscB/OMEGA zülalları və eukariot Fanzorları — ilk dəfə təsvir ediləndə sadəcə yeni biologiya idi. Heç biri hazır alət kimi gəlməmişdi. İki hissəli bələdçisi olan və PAM tələb etməyən sistem həqiqətən fərqli başlanğıc nöqtəsidir; PAM-sız hədəfləmə isə alət yaradanların məhz dəyər verdiyi çeviklik növüdür.

Amma daha sakit nəticə alət perspektivindən daha vacib ola bilər. DNT-kəsən sistemi RNT-ni redaktə edən snoRNP mexanizmi və sıçrayan genlə əlaqələndirməklə iş həyat ağacı boyunca çox fərqli RNT-yönləndirilən sistemləri birləşdirə biləcək təkamül xəttini cızır. Bu, sahənin öz alətlərinin haradan gəldiyini anlama formasını yenidən quran nəticə növüdür — və uzun müddətdə “qayçılar” haqqında növbəti başlıqdan daha dəyərlidir.

Təmiz xülasə

Tədqiqatçılar ardıcıllıqları deyil, zülal formalarını axtararaq TIGR-Tas-ı kəşf etdilər: əsasən bakterial viruslarda və parazit bakteriyalarda tapılan, əvvəllər məlum olmayan RNT ilə yönləndirilən DNT-hədəfləyici sistemlər ailəsi. Onun bələdçi RNT-si qeyri-adidir — təxminən 36 nukleotiddir və DNT-nin əks zəncirlərini oxuyan iki ayrı hədəfləmə seqmenti daşıyır — və CRISPR-dən fərqli olaraq, qonşuluqda “PAM” motivi tələb etmir. DNT-kəsən üzvlər dəqiq kəsdi, onlardan biri insan hüceyrələrini redaktə etmək üçün proqramlaşdırıla bildi (amma səmərəlilik yalnız bir neçə faiz idi), atom səviyyəsinə yaxın struktur isə kompleksin öz hüceyrələrimizdə RNT-ni redaktə edən snoRNP mexanizminə bənzər qurulduğunu göstərdi — bu da RNT ilə yönləndirilən RNT-dəyişdirici və DNT-hədəfləyici sistemlər arasında dərin təkamül əlaqəsinə işarə edir. Bu, RNT-yönləndirilən biologiyanın həqiqi genişlənməsidir və gələcək alətlər üçün mümkün yeni platformadır — fundamental elmi kəşf və konsepsiya sübutudur, yetkin gen redaktoru deyil, “CRISPR 2.0” deyil və terapiya deyil. Təbiətdəki rolu hələ məlum deyil.