Nauja RNR valdomų DNR taikymo sistemų šeima — kitokia nei CRISPR ir dar ne genų redagavimo įrankis

Nauja RNR valdomų molekulinių sistemų medžio šaka

Kartais biologijos straipsnis gauna antraštę, kurios pats niekada neprašė. Šiam teko „naujas CRISPR“. Tikrasis darbas įdomesnis – ir, kaip dažnai būna, kuklesnis.

Pradėkime nuo to, ką išgarsino CRISPR: RNR valdoma sistema. Baltymas neturi būti iš anksto „sukonstruotas“ vienam taikiniui atpažinti. Jis nešasi trumpą RNR – gidą – ir nukreipiamas ten, kur gido seka atitinka taikinį. Pakeitus gidą, pasikeičia taikinys. Būtent šis programuojamumas pavertė CRISPR įrankiu. Tačiau CRISPR nėra vienintelė RNR valdoma sistema gamtoje, todėl šis straipsnis užduoda kantrų klausimą: kiek dar kitokių sistemų egzistuoja ir ko iš jų galima išmokti?

Ieškodami autoriai nesirėmė vien genų sekų panašumu – per ilgą evoliucijos laiką sekos gali per daug nutolti, kad atskleistų senus giminystės ryšius. Jie ieškojo formų. Pradėję nuo CRISPR Cas9 baltymo dalies, kuri laiko gido RNR, tyrėjai peržiūrėjo prognozuotų baltymų struktūrų duomenų bazes ir ieškojo panašiai sulankstytų baltymų. Ši paieška – per bakterinį „šokinėjantį geną“ ir mechanizmą, kuriuo įprastos ląstelės chemiškai modifikuoja savo RNR – nuvedė prie iš tikrųjų naujos sistemos.

Ką padarė autoriai

Struktūrinė paieška atskleidė anksčiau neatpažintą baltymų šeimą, daugiausia koduojamą bakteriofaguose, archėjų virusuose ir mažose parazitinėse bakterijose. Šalia kiekvieno baltymo yra būdinga DNR sritis – ilga pasikartojanti seka, kurią autoriai pavadino TIGR masyvu (Tandem Interspaced Guide RNA). Baltymus jie pavadino Tas (TIGR-associated). Kai kurie Tas yra tik RNR laikanti dalis, o kiti turi prijungtą vieną iš dviejų DNR kerpančių nukleazių domenų – RuvC arba HNH.

Radę šeimą duomenų bazėse, tyrėjai perkėlė sistemas į laboratoriją: ekspresavo jas E. coli, sekoskaitė susidarančias mažąsias RNR, nustatė taisykles, pagal kurias jos suranda DNR taikinį, patikrino, ar nukleazę turinčios versijos iš tikrųjų kerpa DNR, pabandė vieną sistemą užprogramuoti žmogaus ląstelėms redaguoti ir galiausiai užfiksavo veikiantį kompleksą beveik atomine krio-EM raiška.

Ką jie nustatė

Gidas turi dvi taikymosi dalis. TIGR masyvas apdorojamas į maždaug 36 nukleotidų RNR, turinčias du atskirus taikinį atpažįstančius segmentus. Vienas segmentas atpažįsta vieną taikinio DNR grandinę, kitas – priešingą. Abu veikia kartu ir užfiksuoja taikinio vietą. Tai tikras mechanistinis skirtumas nuo CRISPR, kurio gidas vienu ištisiniu ruožu poruojasi su viena grandine.

Nereikia „nusileidimo aikštelės“. Daugelis CRISPR nukleazių gali kirpti tik tada, kai šalia taikinio yra trumpas specifinis DNR motyvas – PAM. Tai riboja galimas taikymosi vietas. TIGR sistemoms tokio reikalavimo nenustatyta: jos rėmėsi pačia taikinio seka. Iš principo PAM nereikalaujanti sistema gali būti nukreipta į daugiau vietų.

Nukleazę turinčios versijos kerpa tiksliai. Mažosios RNR nukreipti RuvC arba HNH turintys Tas baltymai darė švarius, seka specifinius DNR lūžius ir be gido RNR nekirpo.

Vieną versiją pavyko užprogramuoti žmogaus ląstelėse – bet vos vos. Perkeltas į kultivuojamas žmogaus ląsteles ir nukreiptas į šešis skirtingus genus, Tas baltymas sukėlė redagavimą, taigi sistema programuojama ir mūsų ląstelėse. Tačiau efektyvumas buvo mažas – geriausiu atveju keli procentai ląstelių. Šiuolaikiniai optimizuoti CRISPR įrankiai dažnai redaguoja didelę dalį paveiktų ląstelių. Čia parodyta, kad sistema gali veikti, ne kad ji veikia gerai.

Struktūra paaiškino mechanizmą ir užsiminė apie kilmę. Užfiksuotas kompleksas sudarytas iš veidrodinės baltymų poros, laikančios aštuoniukės formos gido RNR, o taikinio DNR jame smarkiai užlenkta. Įdomu tai, kad ši architektūra labai primena box C/D snoRNP kompleksą, kuris eukariotų ląstelėse RNR gidais nukreipia chemines RNR modifikacijas, o ne kerpa DNR.

Natūrali funkcija neaiški. Kai autoriai vieną sistemą ekspresavo E. coli, ji neapsaugojo nuo įsiveržiančių virusų ar plazmidžių – tai įprasta CRISPR funkcija. Vietoj to taikiniu pažymėta plazmidė pamažu išnyko per daug kartų, kas leidžia spėti, kad laukinėje gamtoje sistema galėtų dalyvauti lėtoje mobiliųjų genetinių elementų konkurencijoje, o ne tiesioginėje antivirusinėje gynyboje. Tačiau bandymas atliktas svetimoje, dirbtinėje sistemoje, todėl tikslus atsakymas kol kas paprastas: nežinome, ką TIGR-Tas daro natūralioje aplinkoje.

Ką tai greičiausiai reiškia

Dvi išvados turi skirtingą patikimumo lygį.

Tvirta išvada: žinomų RNR valdomų sistemų pasaulis yra didesnis ir įvairesnis nei CRISPR bei neseniai atrasti jo giminaičiai. TIGR-Tas yra tikrai atskira šaka su savu dviejų segmentų ir PAM nereikalaujančiu DNR atpažinimo mechanizmu. Tai realus biologijos žemėlapio papildymas.

Gilesnė ir labiau spekuliatyvi išvada: kadangi TIGR mechanizmas struktūriškai panašus ir į RNR modifikuojančius snoRNP, ir į žinomą „šokinėjantį geną“, jis gali žymėti evoliucinį ryšį tarp RNR valdomų RNR modifikavimo ir RNR valdomų DNR taikymo sistemų – galimą trūkstamą grandį pasakojime, kaip programuojami RNR gidai paplito gyvybės evoliucijoje.

Ko tai neįrodo

• Tai ne paruoštas genų redagavimo įrankis. Redagavimas žmogaus ląstelėse parodytas, bet efektyvumas menkas – geriausiu atveju keli procentai. Tai programuojamumo įrodymas, ne brandus redaktorius ir juo labiau ne klinikinė technologija.
• Tai ne „CRISPR 2.0“. Kaip šiandieninis įrankis, CRISPR-Cas9 redaguoja daug efektyviau. TIGR-Tas yra nauja architektūra ankstyvoje koncepcijos patikros stadijoje, ne geresnė jau egzistuojančio produkto versija.
• Natūrali biologinė funkcija nežinoma. Viename bandyme sistema neveikė kaip antivirusinė imuninė apsauga, todėl „nauja bakterijų imuninė sistema“ nėra nustatytas faktas.
• Dalis pagrindinio mechanizmo dar neaiški, įskaitant tai, kaip gido RNR nukerpama iki galutinio ilgio ir į kokius natūralius taikinius sistemos nukreiptos. Dauguma jų aptinkamos mikrobuose, kuriuos sunku ar neįmanoma kultivuoti.
• Čia nėra terapijos. Tai mikrobų ir ląstelių kultūrų biologijos atradimas bei charakterizavimas – be ligos, gydymo ar pacientų.

Kiek tvirti yra įrodymai?

Pats atradimas paremtas tvirtai ir neįprastai įvairiais įrodymais: didelio masto struktūrų paieška, laboratorinis RNR susidarymo ir DNR atpažinimo bei kirpimo patvirtinimas, beveik atominė veikiančio komplekso struktūra ir žmogaus ląstelių bandymas. Teiginys „tai nauja, atskira RNR valdoma DNR taikanti šeima“ vienu metu pagrindžiamas keliomis nepriklausomomis kryptimis.

Ankstyva yra visa naudingumo dalis: redagavimas veikia, bet silpnai, o visas optimizavimo kelias, pavertęs CRISPR iš biologinės įdomybės į galingą įrankį, TIGR sistemoms dar tik prasideda. Dar labiau inferencinės yra likusios istorijos dalys. Natūrali funkcija spėjama iš dirbtinio eksperimento, o elegantiškas evoliucinis ryšys remiasi bendra struktūra, ne galutinai atkurta evoliucijos istorija. Straipsnis šiuos lygius atskiria atsargiai.

Kodėl tai svarbu

Ankstesni RNR valdomų sistemų katalogo išplėtimai galiausiai ne kartą davė praktinės naudos. Šiandieninių įrankių pirmtakai – Cas9, Cas12, Cas13, mažesni IscB/OMEGA baltymai ir eukariotiniai Fanzor – pradžioje buvo tiesiog naujai aprašyta biologija. Nė vienas neatėjo kaip paruoštas produktas. Dviejų segmentų gidas ir PAM nereikalaujantis taikymasis yra iš tiesų kitoks pradinis taškas, o lankstumas be PAM yra būtent tai, ką vertina genomo inžinerijos kūrėjai.

Tačiau tylioji išvada gali būti dar svarbesnė už galimą įrankį. Susiedamas DNR kerpančią sistemą su RNR modifikuojančiu snoRNP mechanizmu ir „šokinėjančiu genu“, darbas nubrėžia galimą giją tarp labai skirtingų RNR valdomų sistemų visame gyvybės medyje. Tokie atradimai keičia supratimą, iš kur atsirado mūsų naudojami įrankiai – ir ilgainiui tai gali būti vertingiau už dar vieną antraštę apie molekulines žirkles.

Trumpa santrauka

Ieškodami baltymų formų, o ne vien sekų, tyrėjai atrado TIGR-Tas – anksčiau nežinotą RNR valdomų DNR taikymo sistemų šeimą, daugiausia aptinkamą bakterijų virusuose ir parazitinėse bakterijose. Jos gido RNR neįprasta: maždaug 36 nukleotidų ilgio ir turi du atskirus segmentus, atpažįstančius priešingas DNR grandines. Kitaip nei daugeliui CRISPR sistemų, šalia taikinio nereikia PAM motyvo. Nukleazę turintys nariai tiksliai kerpa DNR, o vieną sistemą pavyko užprogramuoti žmogaus ląstelėse, nors vos kelių procentų efektyvumu. Beveik atominė struktūra parodė panašumą į mūsų ląstelėse RNR modifikuojantį snoRNP mechanizmą, todėl galimas gilus evoliucinis ryšys tarp RNR valdomų RNR modifikavimo ir DNR taikymo sistemų. Tai tikras RNR valdomos biologijos išplėtimas ir galimas naujas pradinis taškas ateities įrankiams – pagrindinės biologijos atradimas ir koncepcijos patikra, ne brandus genų redaktorius, ne „CRISPR 2.0“ ir ne terapija. Natūrali sistemos funkcija kol kas nežinoma.

Be pagražinimų

Ką rodo straipsnis: Naują ir atskirą prokariotuose bei jų virusuose aptinkamą RNR valdomų DNR taikymo sistemų TIGR-Tas šeimą; struktūrų paieška paremtą atradimą; maždaug 36 nt dviejų segmentų, PAM nereikalaujantį gidą, kuris taikosi į abi DNR grandines; tikslų RNR valdomą DNR kirpimą; programuojamą, bet mažo efektyvumo žmogaus ląstelių redagavimą; beveik atominę krio-EM struktūrą; struktūrinius ir evoliucinius ryšius su box C/D snoRNP bei IS110 transpozonais.

Kas tikėtina, bet neįrodyta: Natūrali biologinė funkcija – vienas dirbtinis bandymas leidžia spėti apie mobiliųjų elementų konkurenciją, o ne gynybą; taip pat siūlomas evoliucinis tiltas tarp RNR modifikuojančių ir DNR taikančių RNR valdomų sistemų, grindžiamas struktūriniu panašumu.

Ko tai nerodo: Brandaus ar didelio efektyvumo genų redagavimo įrankio; pranašumo prieš CRISPR kaip įrankį; patvirtintos natūralios funkcijos; viso gido RNR brendimo mechanizmo; jokio terapinio pritaikymo.

Pagrindiniai ribotumai: Žmogaus ląstelių redagavimo efektyvumas mažas; dauguma sistemų žinomos iš sunkiai tiriamų metagenomų, todėl natūralūs taikiniai beveik nežinomi; biologinės funkcijos ir evoliucinės kilmės teiginiai iš dalies inferenciniai; charakterizavimas atliktas mikrobuose ir ląstelių kultūrose, ne ligos kontekste.

Kiek pasitikėti? Daug – kad tai tikra, atskira RNR valdoma DNR taikanti šeima su nauju dviejų segmentų, PAM nereikalaujančiu mechanizmu. Taip pat daug – kad tai dar nėra paruoštas genų redagavimo įrankis, „CRISPR 2.0“ ar terapija. Mažai žinome apie natūralią funkciją ir apie tai, kiek toli sistema nueis kaip technologija. Tinkama laikysena: pagrįstas susidomėjimas nauja biologija ir galimu evoliuciniu ryšiu, bet kantrybė dėl taikymų, kurie tik prasideda.