Uus RNA-juhitavate DNA-sihtivate süsteemide perekond — CRISPR-ist erinev ja veel mitte geeniredigeerimise tööriist

Uus haru RNA-juhitavate masinate puul

Aeg-ajalt ilmub bioloogiaartikkel, millele pannakse külge pealkiri, mida see ise kunagi ei palunud. Selle töö puhul oli selleks „uus CRISPR“. Tegelik tulemus on huvitavam — ja nagu tavaliselt, tagasihoidlikum.

Alustame sellest, mille CRISPR kuulsaks tegi: RNA-juhitav süsteem. Nipp seisneb selles, et valk ei pea olema püsivalt programmeeritud üht kindlat sihtmärki ära tundma. Selle asemel kannab ta lühikest RNA-jupikest — juhendit — ja liigub sinna, kus selle juhendi järjestus sobitub sihtmärgiga. Muuda juhendit, muutub sihtmärk. Just see programmeeritavus tegi CRISPR-ist tööriista. Kuid CRISPR ei ole looduses ainus RNA-juhitav süsteem ning see artikkel esitab kannatliku küsimuse: kui palju teisi selliseid süsteeme leidub ja mida võivad need meile õpetada?

Nende otsimiseks ei otsinud autorid sarnaseid geenijärjestusi — need muutuvad evolutsiooni jooksul liiga palju, et kauged sugulased kergesti välja paistaksid. Nad otsisid kujusid. Lähtudes CRISPR-i Cas9 valgu osast, mis haarab kinni juhend-RNA-st, kammisid nad ennustatud valgustruktuuride andmebaase, otsides sama ehitusviisiga valke. See rada viis — bakteriaalse „hüppava geeni“ ja tavaliste rakkude enda RNA keemiliseks muutmiseks kasutatava masinavärgi kaudu — millegi tõepoolest uueni.

Mida autorid tegid

Struktuuriotsing tõi esile varem tundmatu valguperekonna, mida kodeeritakse peamiselt bakteriofaagides (baktereid nakatavates viirustes), arheviirustes ja tillukestes parasiitsetes bakterites. Iga sellise valgu kõrval paikneb iseloomulik DNA-lõik: pikk korduv massiiv, mille autorid nimetasid TIGR-massiiviks (Tandem Interspaced Guide RNA). Valke endid nimetasid nad Tas-valkudeks (TIGR-associated). Mõni Tas-valk koosneb sisuliselt vaid RNA-d siduvast osast; teistel on külge liidetud DNA lõikav tööriist — üks kahest molekulaarkääride tüübist, RuvC või HNH.

Pärast perekonna leidmist andmebaasist viisid nad selle laborisse: süsteemid ekspresseeriti E. coli’s ja sekveneeriti nende toodetud väikesed RNA-d, määrati reeglid, mille järgi RNA DNA-sihtmärgi leiab, kontrolliti, kas lõikavad variandid tõepoolest lõikavad, prooviti üht neist programmeerida inimese rakke muutma ning lõpuks külmutati töötav kompleks ja kujutati selle struktuuri peaaegu aatomtaseme lahutusega.

Mida nad leidsid

Juhend koosneb kahest osast. TIGR-massiiv töödeldakse umbes 36 nukleotiidi pikkusteks RNA-deks, millest igaüks kannab kahte eraldi sihtmärki ära tundvat lõiku. Üks lõik loeb siht-DNA üht ahelat, teine vastasahelat. Koos kinnitavad need süsteemi kindlale kohale. See erineb mehhanistiliselt päriselt CRISPR-ist, mille juhend sobitub ühe ahelaga ühe katkematu lõiguna.

Ja „maandumisplatsi“ pole vaja. Paljud CRISPR-nukleaasid saavad lõigata ainult siis, kui sihtmärgi kõrval asub lühike kindel DNA-motiiv ehk PAM — piirang, mis vähendab võimalike sihtkohtade hulka. TIGR-süsteemidel sellist nõuet ei leitud: nad tuginesid ainult sihtjärjestusele endale. PAM-i mitte vajavat süsteemi saab põhimõtteliselt suunata rohkematesse kohtadesse.

Lõikavad variandid lõikavad täpselt. Väike RNA juhib RuvC- või HNH-d sisaldavad Tas-valgud DNA-le, kus need tekitasid puhtaid järjestusspetsiifilisi katkeid — ja ilma juhendita ei teinud midagi.

Üht varianti sai programmeerida muutma inimese rakke — vaevu. Kui Tas-valk viidi kultuuris inimese rakkudesse ja suunati kuue eri geeni vastu, tekitas see tõepoolest muutusi, kinnitades, et süsteemi saab programmeerida ka meie rakkudes. Tõhusus oli aga väike: parimal juhul mõni protsent rakkudest. Võrdluseks muudavad tänapäeva optimeeritud CRISPR-tööriistad tavaliselt suurt osa rakkudest, kuhu need viiakse. See tõestab, et süsteem võib töötada, mitte et see töötab hästi.

Struktuur selgitas mehhanismi — ja vihjas päritolule. Kujutatud kompleks koosneb peegelsümmeetrilisest valgupaarist, mis hoiab kinni kaheksakujulist juhend-RNA-d, samal ajal kui siht-DNA teeb kompleksis järsu pöörde. Tähelepanuväärselt meenutab see arhitektuur tugevalt meie enda rakkude sugulastes leiduvat box C/D „snoRNP“-masinavärki, mis juhib DNA lõikamise asemel RNA keemilisi modifikatsioone.

Looduslik ülesanne on ebaselge. Kui autorid ekspresseerisid üht süsteemi E. coli’s, ei kaitsnud see rakku sissetungivate viiruste ega plasmiidide eest — see on CRISPR-i tavapärane „päevatöö“. Selle asemel eemaldas süsteem paljude põlvkondade jooksul aegamisi sihitud plasmiidi, vihjates, et tema tegelik roll võib olla mobiilsete DNA-elementide aeglases konkurentsis, mitte esmases immuunkaitses. Kuid see oli võõras ja kunstlik katsekeskkond ning aus vastus on, et keegi ei tea veel, mida need süsteemid looduses teevad.

Mida see tõenäoliselt tähendab

Kaks asja, erineva kindlusega.

Kindel järeldus: RNA-juhitavate süsteemide teadaolev maailm on suurem ja mitmekesisem kui CRISPR ja selle hiljuti leitud sugulased. TIGR-Tas on tõepoolest eraldi haru oma kaheosalise, PAM-i mitte vajava DNA-tuvastusviisiga. See on päris täiendus kaardile.

Sügavam ja spekulatiivsem järeldus: kuna TIGR-i masinavärk on ehitatud sarnaselt meiega sarnaste rakkude RNA-d muutvale snoRNP-le ning samuti tuntud „hüppavale geenile“, võib see tähistada evolutsioonilist seost RNA-juhitavate RNA-d muutvate ja RNA-juhitavate DNA-d sihtivate süsteemide vahel — võimalikku puuduvat lüli loos sellest, kuidas programmeeritavad RNA-juhendid elusorganismides tekkisid.

Mida see ei tõesta

• See ei ole valmis geeniredigeerimise tööriist. Inimese rakkudes redigeerimist näidati, kuid see oli nõrk — parimal juhul mõni protsent. See on programmeeritavuse tõestus, mitte küps redaktor, ja kliinilisest kasutusest väga kaugel.
• See ei ole „CRISPR 2.0“. Praeguse tööriistana mõõdetuna redigeerib CRISPR-Cas9 seda tohutult paremini. TIGR-Tas on uus arhitektuur tõestuskontseptsiooni etapis, mitte olemasoleva toote parem versioon.
• Selle bioloogiline roll on teadmata. Ühes katses ei käitunud see viirusevastase immuunsüsteemina; väide „uus bakteriaalne immuunsüsteem“ ei ole tõendatud.
• Suur osa põhimehhanismist on endiselt lahtine — sealhulgas see, kuidas juhend-RNA lõigatakse lõplikku pikkusesse ja mida need süsteemid looduses üldse sihivad (enamik neist elab mikroobides, mida suudame vaevu kasvatada).
• Siin ei ole midagi ravialast. Tegemist on avastamise ja iseloomustamisega mikroobides ja rakukultuuris — ei haigust, ravi ega patsienti.

Kui tugev on tõendusmaterjal?

Avastus ise toetub kindlale pinnale ja on ebatavaliselt mitmekülgselt kinnitatud: algul suuremahuline struktuuride kaevandamine, seejärel laboris RNA tekkimise ning DNA leidmise ja lõikamise kontroll, siis töötava kompleksi peaaegu aatomlahutusega struktuur ja lisaks katse inimese rakkudes. Väide „see on uus, eristuv RNA-juhitavate DNA-sihtivate süsteemide perekond“ saab toetust mitmest sõltumatust suunast.

Varajases faasis on kõik kasutatavusega seotu: redigeerimine toimib, kuid vaevu, ja kogu optimeerimine, mis muutis CRISPR-i bioloogilisest kurioosumist tööriistaks, on TIGR-i puhul alles ees. Järelduslik on aga ülejäänud lugu — loodusliku rolli kohta tehakse mõistlik oletus kunstliku eksperimendi põhjal ja evolutsiooniline seos, kuigi elegantne, on argument ühise struktuuri, mitte lõplikult tõestatud ajaloo põhjal. Artikkel ise eristab neid tasandeid hoolikalt.

Miks see oluline on

Varasemad RNA-juhitavate süsteemide kataloogi laiendused on hiljem korduvalt kasulikuks osutunud. Tänaste tööriistade taga olevad süsteemid — Cas9, Cas12, Cas13 ning hiljem väiksemad IscB/OMEGA valgud ja eukarüootsed Fanzorid — olid algul kõik lihtsalt äsja kirjeldatud bioloogia. Ükski neist ei saabunud valmis tööriistana. Kaheosalise juhendi ja PAM-i vajaduseta süsteem on tõepoolest teistsugune lähtepunkt ning PAM-vaba sihtimine on just selline paindlikkus, mida tööriistade arendajad hindavad.

Kuid vaiksem tulemus võib olla tööriistaväljavaatest tähtsamgi. Sidudes DNA-d lõikava süsteemi RNA-d muutva snoRNP-masinavärgi ja hüppava geeniga, visandab töö võimaliku niidi, mis ühendab väga erinevaid RNA-juhitavaid süsteeme elupuu eri osades. Selline leid võib muuta seda, kuidas terve valdkond mõistab oma tööriistade päritolu — ja pikemas vaates võib see olla väärtuslikum kui järjekordne pealkiri molekulaarsetest kääridest.

Lühidalt

Valgu kujusid, mitte järjestusi otsides avastasid teadlased TIGR-Tasi: varem tundmatu RNA-juhitavate DNA-sihtivate süsteemide perekonna, mida leidub peamiselt bakteriviirustes ja parasiitsetes bakterites. Selle juhend-RNA on ebatavaline — umbes 36 nukleotiidi pikk ja sisaldab kahte eraldi sihtivat lõiku, mis loevad DNA vastasahelaid — ning erinevalt CRISPR-ist ei vaja süsteem kõrvalasuvat PAM-motiivi. DNA-d lõikavad liikmed lõikavad täpselt, üht varianti sai programmeerida muutma inimese rakke (kuigi ainult mõneprotsendilise tõhususega) ja peaaegu aatomlahutusega struktuur näitas kompleksi, mis sarnaneb meie enda rakkudes RNA-d muutva snoRNP-masinavärgiga — vihjates sügavale evolutsioonilisele seosele RNA-juhitavate RNA-muutvate ja DNA-sihtivate süsteemide vahel. See laiendab päriselt meie teadmisi RNA-juhitavast bioloogiast ja võib pakkuda tulevastele tööriistadele uut lähteplatvormi — kuid tegemist on fundamentaalbioloogilise avastuse ja tõestuskontseptsiooniga, mitte küpse geeniredaktori, „CRISPR 2.0“ ega raviga. Selle looduslik ülesanne on endiselt teadmata.

Kaine hinnang

Mida artikkel näitab: Uut ja eristuvat RNA-juhitavate DNA-sihtivate süsteemide perekonda (TIGR-Tas) prokarüootides ja nende viirustes, mis leiti struktuuride kaevandamisega; kahe segmendiga PAM-vaba juhend-RNA-d (~36 nt), mis sihib järjestikku mõlemat DNA-ahelat; nukleaasi sisaldavate liikmete täpset RNA-juhitavat DNA lõikamist; programmeeritavat redigeerimist inimese rakkudes väikese tõhususega (kuni mõni protsent); peaaegu aatomlahutusega krüo-EM-struktuuri; ning struktuurilisi/evolutsioonilisi seoseid box C/D snoRNP-de ja IS110 transposoonidega.

Mis on usutav, kuid tõestamata: Süsteemide looduslik bioloogiline roll (üks kunstlik katse vihjab kaitsefunktsioonist erinevale rollile mobiilsete elementide konkurentsis); oletatav evolutsiooniline sild RNA-d muutvate ja DNA-d sihtivate RNA-juhitavate süsteemide vahel (struktuuril põhinev argument).

Mida see ei näita: Küpset või suure tõhususega geeniredigeerimise tööriista; paremust CRISPR-i ees tööriistana; kinnitatud looduslikku funktsiooni; seda, kuidas juhend-RNA küpseb; ega ühtki ravirakendust.

Peamised piirangud: Inimese rakkude redigeerimise tõhusus on väike (ainult tõestuskontseptsioon); enamik süsteeme pärineb raskesti uuritavatest metagenoomidest, mistõttu nende looduslikud sihtmärgid on suures osas teadmata; väited bioloogilise rolli ja evolutsioonilise päritolu kohta on järelduslikud; iseloomustamine toimus mikroobides ja rakukultuuris, mitte haiguskontekstis.

Kui kindel võiks tavalugeja olla? Väga kindel, et tegemist on tõelise, selgelt eristuva RNA-juhitavate DNA-sihtivate süsteemide perekonnaga, millel on uudne kaheosaline PAM-vaba mehhanism, ning et struktuurilised ja evolutsioonilised tähelepanekud on sisukad. Samuti väga kindel, et see ei ole valmis geeniredigeerimise tööriist, „CRISPR 2.0“ ega ravi. Süsteemi loodusliku rolli ja tulevase tööriistapotentsiaali osas on kindlus väike. Sobiv hoiak: tõeline elevus uue bioloogia ja võimaliku evolutsioonilise puuduva lüli üle — ning kannatlikkus rakenduste suhtes, mis on alles päris alguses.