Uusi RNA-ohjattujen DNA:han kohdistuvien järjestelmien perhe — eri asia kuin CRISPR, eikä vielä geenieditointityökalu

Uusi haara RNA-ohjattujen koneistojen sukupuussa

Aina silloin tällöin biologian tutkimus saa otsikon, jota se ei itse pyytänyt. Tämän kohdalla se oli ”uusi CRISPR”. Taustalla oleva työ on sitä kiinnostavampi — ja kuten tavallista, myös maltillisempi.

Aloitetaan asiasta, jonka CRISPR teki tunnetuksi: RNA-ohjatusta järjestelmästä. Juju on siinä, ettei proteiinia tarvitse rakentaa tunnistamaan vain yhtä kohdetta. Sen sijaan se kantaa mukanaan lyhyttä RNA-pätkää — opasta — ja menee sinne, missä oppaan sekvenssi vastaa kohdetta. Vaihda opas, ja kohde vaihtuu. Juuri tämä ohjelmoitavuus teki CRISPRistä työkalun. CRISPR ei kuitenkaan ole luonnon ainoa RNA-ohjattu järjestelmä. Tämä tutkimus kysyy kärsivällisemmän kysymyksen: kuinka paljon muita tyyppejä on olemassa, ja mitä ne voivat opettaa meille?

Etsiessään niitä tutkijat eivät etsineet toisiaan muistuttavia geenisekvenssejä — ne muuttuvat evoluution aikana liikaa, jotta kaukaiset sukulaiset löytyisivät helposti. He etsivät muotoja. Lähtökohtana oli CRISPRin Cas9-proteiinin osa, joka tarttuu opas-RNA:han. Ennustettujen proteiinirakenteiden tietokannoista etsittiin samalla tavoin rakennettuja proteiineja. Jäljet johtivat bakteerien ”hyppivän geenin” ja tavallisten solujen omaa RNA:ta kemiallisesti muokkaavan koneiston kautta johonkin aidosti uuteen.

Mitä tutkijat tekivät

Rakenteellinen haku paljasti aiemmin tunnistamattoman proteiiniperheen, jota koodaavia geenejä esiintyy etenkin bakteriofageissa eli bakteereja infektoivissa viruksissa, arkeonien viruksissa ja pienissä loisivissa bakteereissa. Kunkin vieressä on tunnusomainen DNA-jakso: pitkä toistuva alue, jonka tutkijat nimesivät TIGR-alueeksi (Tandem Interspaced Guide RNA). Proteiinit saivat nimen Tas (TIGR-associated). Osa Tas-proteiineista koostuu vain RNA:han tarttuvasta osasta, kun taas toisiin on liitetty DNA:ta leikkaava väline — jompikumpi kahdesta molekyylisaksityypistä, RuvC tai HNH.

Kun perhe oli löytynyt tietokannasta, tutkijat veivät sen laboratorioon. He ilmensivät järjestelmiä E. colissa ja sekvensoivat niiden tuottamat pienet RNA:t, selvittivät säännöt joilla nämä RNA:t löytävät DNA-kohteen, testasivat leikkaavatko nukleaasiversiot todella DNA:ta, yrittivät ohjelmoida yhden niistä muokkaamaan ihmissoluja ja lopuksi jäädyttivät toimivan kompleksin ja kuvasivat sen rakenteen lähes atomitarkkuudella.

Mitä he löysivät

Opas koostuu kahdesta osasta. TIGR-alue prosessoidaan noin 36 merkin pituisiksi RNA-molekyyleiksi, joista jokainen sisältää kaksi erillistä kohdistusjaksoa. Toinen lukee kohde-DNA:n yhtä juostetta ja toinen vastakkaista juostetta. Ne toimivat yhdessä ja lukitsevat kohdan. Tämä poikkeaa aidosti CRISPRin mekanismista, jossa opas vastaa yhtä juostetta yhtenäisenä jaksona.

Eikä se tarvitse ”laskeutumispaikkaa”. Monet CRISPR-nukleaasit voivat leikata vain, jos kohteen vieressä on lyhyt tietty DNA-motiivi eli ”PAM”. Se rajoittaa paikkoja, joihin niitä voi kohdistaa. TIGR-järjestelmissä tällaista vaatimusta ei havaittu: ne perustuivat pelkkään kohdesekvenssiin. PAMia tarvitsematon järjestelmä voidaan periaatteessa kohdistaa useampiin paikkoihin.

Leikkaavat versiot leikkaavat täsmällisesti. Pienen RNA:n ohjaamina RuvC- tai HNH-osan sisältävät Tas-proteiinit tekivät DNA:han siistejä, sekvenssispesifisiä katkoja — eivätkä tehneet mitään ilman opasta.

Yksi versio voitiin ohjelmoida muokkaamaan ihmissoluja — juuri ja juuri. Kun Tas-proteiini vietiin viljeltyihin ihmissoluihin ja kohdistettiin kuuteen eri geeniin, se tuotti muokkauksia. Järjestelmä on siis ohjelmoitavissa myös soluissamme. Tehokkuus oli kuitenkin pieni: parhaimmillaan vain muutama prosentti soluista. Vertailuksi nykyiset optimoidut CRISPR-työkalut muokkaavat tavallisesti suuren osan soluista, joihin ne viedään. Tämä osoittaa, että järjestelmä voi toimia, ei että se toimisi hyvin.

Rakenne selitti mekanismia — ja vihjasi alkuperästä. Kuvattu kompleksi koostuu peilisymmetrisestä proteiiniparista, joka ympäröi kahdeksikon muotoista opas-RNA:ta, samalla kun kohde-DNA taipuu jyrkästi. Huomionarvoista on, että rakenne muistuttaa läheisesti myös omien solujemme sukulaisissa esiintyvää box C/D -snoRNP-koneistoa, joka ohjaa RNA:n kemiallisia muokkauksia DNA:n leikkaamisen sijaan.

Luonnollinen tehtävä on epäselvä. Kun tutkijat ilmensivät yhtä järjestelmää E. colissa, se ei torjunut tunkeutuvia viruksia tai plasmideja, kuten CRISPR tavallisesti tekee. Sen sijaan se poisti kohteeksi asetettua plasmidia vähitellen monien sukupolvien aikana. Tämä vihjaa, että luonnollinen tehtävä voisi liittyä liikkuvien DNA-elementtien hitaaseen kilpailuun eikä etulinjan immuunipuolustukseen. Koe tehtiin kuitenkin lainatussa, keinotekoisessa ympäristössä, ja rehellinen vastaus on, ettei kukaan vielä tiedä mitä nämä järjestelmät tekevät luonnossa.

Mitä tämä todennäköisesti tarkoittaa

Kaksi asiaa, joihin voi suhtautua eri varmuudella.

Vahva johtopäätös: tunnettu RNA-ohjattujen järjestelmien maailma on CRISPRiä ja sen hiljattain löydettyjä sukulaisia laajempi ja monimuotoisempi. TIGR-Tas on aidosti oma haaransa, jolla on kaksiosainen, PAMista riippumaton tapa tunnistaa DNA:ta. Se on todellinen lisä karttaan.

Syvempi ja spekulatiivisempi tulkinta: koska TIGR-koneisto muistuttaa rakenteeltaan soluissamme RNA:ta muokkaavaa snoRNP:tä sekä tunnettua ”hyppivää geeniä”, se voi edustaa evolutiivista yhteyttä RNA-ohjattujen RNA:ta muokkaavien ja RNA-ohjattujen DNA:han kohdistuvien järjestelmien välillä — mahdollista puuttuvaa palaa siinä, miten ohjelmoitavat RNA-oppaat kehittyivät eri eliöissä.

Mitä tämä ei todista

• Se ei ole valmis geenieditointityökalu. Muokkaus ihmissoluissa osoitettiin, mutta se oli heikkoa — parhaimmillaan muutaman prosentin luokkaa. Se todistaa ohjelmoitavuuden, ei valmista editoria, ja kliinisiin sovelluksiin on pitkä matka.
• Se ei ole ”CRISPR 2.0”. Nykyisenä työkaluna CRISPR-Cas9 muokkaa soluja paljon tehokkaammin. TIGR-Tas on uusi arkkitehtuuri periaatteen toimivuuden osoittamisen vaiheessa, ei paremmin toimiva versio olemassa olevasta tuotteesta.
• Sen biologista tehtävää ei tunneta. Yhdessä tätä ajatusta testaavassa kokeessa se ei toiminut viruksia torjuvana immuunijärjestelmänä; väite ”uudesta bakteerien immuunijärjestelmästä” ei siis ole osoitettu.
• Suuri osa perusmekanismista on yhä avoin — esimerkiksi se, miten opas-RNA leikataan lopulliseen pituuteensa ja mihin nämä järjestelmät luonnossa todella kohdistuvat. Useimmat löytyvät mikrobeista, joita tuskin pystymme viljelemään.
• Tässä ei ole vielä mitään terapeuttista. Kyse on mikrobeissa ja soluviljelmissä tehdystä löydöstä ja karakterisoinnista — ei sairaudesta, hoidosta tai potilaasta.

Kuinka vahvaa näyttö on?

Itse löytö on vahvalla pohjalla ja poikkeuksellisen monipuolisesti tuettu. Se alkaa laajamittaisesta rakenteiden louhinnasta, jatkuu laboratoriovarmistuksilla siitä, miten RNA syntyy ja löytää sekä leikkaa DNA:n, sisältää lähes atomitarkkuudella kuvatun toimivan kompleksin rakenteen ja lisäksi testin ihmissoluissa. Väite ”tämä on uusi, erillinen RNA-ohjattu DNA:han kohdistuva perhe” saa tukea useasta suunnasta yhtä aikaa.

Varhaisessa vaiheessa on kaikki käyttökelpoisuuteen liittyvä: muokkaus toimii, mutta juuri ja juuri. Kaikki optimointi, joka muutti CRISPRin kuriositeetista työkaluksi, on TIGRin kohdalla vielä edessä. Päätelmänvaraista on muu tarina: luonnollisesta tehtävästä tehdään järkevä arvaus keinotekoisen kokeen perusteella, ja elegantti evoluutioyhteys perustuu jaettuun rakenteeseen, ei ratkaistuun historialliseen tapahtumaketjuun. Tutkimus erottaa nämä tasot huolellisesti toisistaan.

Miksi tällä on merkitystä

RNA-ohjattujen järjestelmien luettelon aiemmat laajennukset ovat joskus osoittautuneet hyvin hyödyllisiksi. Nykyisten työkalujen taustalla olevat Cas9, Cas12, Cas13 ja uudemmat pienemmät IscB/OMEGA-proteiinit sekä eukaryoottiset Fanzorit olivat aluksi vain uutta kuvattua biologiaa. Yksikään ei saapunut valmiina työkaluna. Kaksiosainen opas ilman PAM-vaatimusta on aidosti erilainen lähtökohta, ja PAM-vapaa kohdistus on juuri sellaista joustavuutta, jota työkalujen kehittäjät arvostavat.

Hiljaisempi tulos saattaa silti olla työkalunäkymiä tärkeämpi. Yhdistämällä DNA:ta leikkaavan järjestelmän RNA:ta muokkaavaan snoRNP-koneistoon ja hyppivään geeniin tutkimus hahmottelee mahdollista säiettä, joka yhdistää hyvin erilaisia RNA-ohjattuja järjestelmiä elämän sukupuussa. Tällainen havainto voi järjestää uudelleen kokonaisen alan käsityksen siitä, mistä sen työkalut ovat peräisin — ja pitkällä aikavälillä se voi olla arvokkaampaa kuin jälleen yksi otsikko molekyylisaksista.

Lyhyesti

Etsimällä proteiinien muotoja sekvenssien sijaan tutkijat löysivät TIGR-Tasin: aiemmin tuntemattoman RNA-ohjattujen DNA:han kohdistuvien järjestelmien perheen, jota esiintyy enimmäkseen bakteeriviruksissa ja loisivissa bakteereissa. Sen opas-RNA on epätavallinen: noin 36 nukleotidia pitkä ja sisältää kaksi erillistä kohdistusjaksoa, jotka lukevat DNA:n vastakkaisia juosteita. Toisin kuin CRISPR, se ei tarvitse viereistä PAM-motiivia. DNA:ta leikkaavat jäsenet leikkasivat tarkasti, yksi voitiin ohjelmoida muokkaamaan ihmissoluja — joskin vain muutaman prosentin tehokkuudella — ja lähes atomitarkka rakenne paljasti kompleksin, joka muistuttaa omissa soluissamme RNA:ta muokkaavaa snoRNP-koneistoa. Tämä vihjaa syvään evolutiiviseen yhteyteen RNA-ohjattujen RNA:ta muokkaavien ja DNA:han kohdistuvien järjestelmien välillä. TIGR-Tas laajentaa aidosti RNA-ohjattua biologiaa ja voi toimia tulevien työkalujen uutena runkona — mutta se on perustutkimuslöytö ja periaatteen toimivuuden osoitus, ei valmis geenieditori, ei ”CRISPR 2.0” eikä hoito. Sen luonnollista tehtävää ei tunneta.

Ei-hölynpölyä-tarkistus

Mitä tutkimus osoittaa: Prokaryooteissa ja niiden viruksissa on uusi, erillinen RNA-ohjattujen DNA:han kohdistuvien TIGR-Tas-järjestelmien perhe, joka löydettiin rakenteita louhimalla; noin 36 nt:n kaksiosainen PAM-vapaa opas-RNA kohdistuu DNA:n molempiin juosteisiin; nukleaasin sisältävät jäsenet leikkaavat DNA:ta täsmällisesti RNA:n ohjaamina; järjestelmä voidaan ohjelmoida muokkaamaan ihmissoluja pienellä, korkeintaan muutaman prosentin tehokkuudella; kompleksista saatiin lähes atomitarkka cryo-EM-rakenne; ja sillä on rakenteellisia/evolutiivisia yhteyksiä box C/D snoRNP -koneistoihin ja IS110-transposoneihin.

Mikä on uskottavaa mutta todistamatta: Järjestelmien luonnollinen biologinen tehtävä — yksi keinotekoinen koe vihjaa muuhun kuin puolustukseen liittyvään rooliin liikkuvien elementtien kilpailussa — sekä ehdotettu evolutiivinen silta RNA:ta muokkaavien ja DNA:han kohdistuvien RNA-ohjattujen järjestelmien välillä, joka perustuu rakenteelliseen argumenttiin.

Mitä tutkimus ei osoita: Valmista tai tehokasta geenieditointityökalua; CRISPRiä parempaa työkalua; vahvistettua luonnollista tehtävää; sitä, miten opas-RNA kypsyy; tai terapeuttista sovellusta.

Tärkeimmät rajoitukset: Ihmissolujen muokkaustehokkuus on pieni ja vasta periaatteen toimivuuden tasolla; useimmat järjestelmät löytyvät vaikeasti tutkittavista metagenomeista, joten luonnolliset kohteet ovat suurelta osin tuntemattomia; biologista tehtävää ja evolutiivista alkuperää koskevat väitteet ovat päätelmiä; karakterisointi tehtiin mikrobeissa ja soluviljelmässä, ei sairauskontekstissa.

Kuinka paljon yleislukijan kannattaa luottaa tulokseen? Korkealla varmuudella kyseessä on aito, erillinen uusi RNA-ohjattujen DNA:han kohdistuvien järjestelmien perhe, jolla on uusi kaksiosainen PAM-vapaa mekanismi, ja rakenteelliset sekä evolutiiviset havainnot ovat todellisia. Yhtä korkealla varmuudella se ei ole valmis geenieditointityökalu, ”CRISPR 2.0” tai hoito. Sen luonnollisesta tehtävästä ja tulevasta hyödyllisyydestä työkaluna varmuus on pieni. Oikea asenne: aitoa innostusta uudesta biologiasta ja mahdollisesta evoluution puuttuvasta lenkistä — sekä kärsivällisyyttä sovellusten suhteen, sillä ne ovat vasta alussa.