'n Nuwe familie van RNA-geleide, DNA-teikenende stelsels — anders as CRISPR, en nog nie 'n geen-redigeringshulpmiddel nie

'n Nuwe tak aan die boom van RNA-geleide masjiene

Af en toe verskyn daar 'n biologie-artikel met 'n opskrif waarvoor dit nooit gevra het nie. Dié een s’n was “'n nuwe CRISPR”. Die werk daaragter is interessanter as dit — en, soos gewoonlik, beskeidener.

Begin by die ding wat CRISPR beroemd gemaak het: 'n RNA-geleide stelsel. Die kuns is dat die proteïen nie vas bedraad hoef te wees om een teiken te herken nie. In plaas daarvan dra dit 'n kort stukkie RNA — 'n gids — en gaan dit oral waar daardie gids se volgorde ooreenstem. Verander die gids, verander die teiken. Daardie programmeerbaarheid is die hele rede waarom CRISPR 'n hulpmiddel geword het. Maar CRISPR is nie die enigste RNA-geleide stelsel in die natuur nie, en die vraag wat hierdie artikel stel, is die geduldige een: hoeveel ander soorte is daar buite, en wat kan hulle ons leer?

Om te soek, het die outeurs nie na ooreenstemmende geenvolgordes gesoek nie — dié dryf oor evolusionêre tyd te veel om verre verwante te openbaar. Hulle het na vorme gesoek. Vertrekkende van die deel van CRISPR se Cas9-proteïen wat sy gids-RNA vasgryp, het hulle databasisse van voorspelde proteïenstrukture deursoek na enigiets wat op dieselfde manier gebou is. Daardie spoor het gelei — via 'n bakteriële “springende geen” en 'n stuk masjinerie wat gewone selle gebruik om hul eie RNA chemies te verstel — na iets werklik nuuts.

Wat die outeurs gedoen het

Die strukturele soektog het 'n voorheen onherkende familie proteïene aan die lig gebring, wat meestal in bakteriofae (virusse wat bakterieë besmet), in virusse van archaea en in piepklein parasitiese bakterieë gekodeer word. Elkeen sit langs 'n kenmerkende stuk DNA: 'n lang, herhalende reeks wat die outeurs 'n TIGR-skikking genoem het (vir Tandem Interspaced Guide RNA). Die proteïene het hulle Tas genoem (TIGR-geassosieer). Sommige Tas-proteïene is net die kaal RNA-grypende deel; ander het 'n DNA-sny-gereedskap daaraan vasgeheg — een van twee soorte molekulêre skêre (RuvC of HNH genoem).

Nadat hulle die familie in die databasis gevind het, het hulle dit na die laboratorium geneem: hulle het die stelsels in E. coli tot uitdrukking gebring en die volgorde bepaal van die klein RNA’s wat hulle gemaak het, die reëls uitgewerk waarvolgens daardie RNA’s 'n DNA-teiken vind, getoets of die snyende weergawes werklik sny, probeer om een te programmeer om menslike selle te redigeer, en uiteindelik 'n werkende kompleks gevries en die struktuur daarvan teen byna-atomêre resolusie afgebeeld.

Wat hulle gevind het

Die gids kom in twee stukke. Die TIGR-skikking word verwerk tot kort RNA’s van ongeveer 36 letters, wat elk twee afsonderlike teikensegmente dra. Een segment lees die een string van die teiken-DNA; die ander lees die teenoorgestelde string. Die twee werk in tandem om 'n plek vas te pen. Dit is 'n werklike meganistiese wegbreek van CRISPR, wie se gids met 'n enkele string in een deurlopende stuk ooreenstem.

En dit het geen “landingsblad” nodig nie. Baie CRISPR-nukleases kan net langs 'n kort, spesifieke DNA-motief ('n “PAM”) sny wat langs die teiken sit — 'n beperking wat inperk waar hulle kan mik. Die TIGR-stelsels het geen sodanige vereiste getoon nie: hulle het slegs op die teikenvolgorde staatgemaak. 'n Stelsel wat nie 'n PAM nodig het nie, kan in beginsel na meer plekke gerig word.

Die snyende weergawes sny, en wel presies. Gelei deur die klein RNA, het die RuvC- en HNH-draende Tas-proteïene skoon, volgorde-spesifieke breuke in DNA gemaak — en niks sonder die gids gedoen nie.

Een weergawe kon geprogrammeer word om menslike selle te redigeer — net-net. Oorgeplaas na menslike selle in 'n bakkie en op ses verskillende gene gemik, het 'n Tas-proteïen wel redigerings aangebring, wat bevestig dat die stelsel ook in ons selle programmeerbaar is. Maar die doeltreffendheid was laag: op sy beste 'n paar persent van die selle. Ter vergelyking: vandag se geoptimaliseerde CRISPR-gereedskap redigeer roetineweg 'n groot deel van die selle waarin dit geplaas word. Dit is 'n bewys dat dit kan werk, nie 'n hulpmiddel wat goed werk nie.

Die struktuur het die meganisme verklaar — en 'n aanduiding van sy oorsprong gegee. Die afgebeelde kompleks is 'n spieël-simmetriese paar proteïene wat die agt-vormige gids-RNA omklem, met die teiken-DNA wat deur 'n skerp draai gebuig is. Opvallend is dat daardie argitektuur sterk lyk soos 'n masjien wat by ons eie selle se verwante voorkom — die boks C/D-“snoRNP”, wat chemiese redigerings aan RNA lei eerder as om DNA te sny.

Sy natuurlike taak is onduidelik. Toe die outeurs een stelsel in E. coli tot uitdrukking gebring het, het dit indringende virusse of plasmiede nie afgeweer nie — die daaglikse werk van CRISPR. In plaas daarvan het dit 'n geteikende plasmied geleidelik oor baie geslagte uitgewis, wat daarop dui dat sy werklike rol eerder in stadige mededinging tussen mobiele stukke DNA lê as in voorste immuunverdediging. Maar dit was 'n geleende, kunsmatige omgewing, en die eerlike antwoord is dat niemand nog weet wat hierdie stelsels in die natuur doen nie.

Wat dit waarskynlik beteken

Twee dinge, met verskillende vlakke van sekerheid.

Die stewige een: die bekende wêreld van RNA-geleide stelsels is groter en meer gevarieerd as CRISPR en sy onlangs gevonde neefs. TIGR-Tas is 'n werklik afsonderlike tak, met sy eie tweedelige, PAM-vrye manier om DNA te herken. Dit is 'n werklike toevoeging tot die kaart.

Die dieper, meer spekulatiewe een: omdat die TIGR-masjinerie gebou is soos die snoRNP wat RNA in selle soos ons s’n redigeer, en soos 'n bekende “springende geen”, kan dit 'n evolusionêre skakel merk tussen RNA-geleide RNA-modifiserende stelsels en RNA-geleide DNA-teikenende stelsels — 'n moontlike ontbrekende stuk in die verhaal van hoe programmeerbare RNA-gidse regoor die lewe ontstaan het.

Wat dit nie bewys nie

• Dit is nie 'n kant-en-klare geen-redigeringshulpmiddel nie. Redigering in menslike selle is gedemonstreer, maar was swak — op sy beste 'n paar persent. Dit is 'n bewys van programmeerbaarheid, nie 'n volwasse redigeerder nie, en ver van enigiets klinies.
• Dit is nie “CRISPR 2.0” nie. Gemeet as 'n hulpmiddel van vandag, redigeer CRISPR-Cas9 dit verreweg beter. TIGR-Tas is 'n nuwe argitektuur in die stadium van konsepbewys, nie 'n beter weergawe van 'n bestaande produk nie.
• Sy biologiese rol is onbekend. Dit het in die enigste toets van daardie idee nie as 'n antivirus-immuunstelsel opgetree nie; “'n nuwe bakteriële immuunstelsel” is nie vasgestel nie.
• 'n Groot deel van die basiese meganisme is steeds oop — insluitend hoe die gids-RNA tot sy finale lengte gesny word, en waarop hierdie stelsels in die natuur eintlik teiken (die meeste leef in mikrobes wat ons skaars kan kweek).
• Daar is niks terapeuties hier nie. Dit is ontdekking en karakterisering in mikrobes en selkultuur — geen siekte, geen behandeling, geen pasiënt nie.

Hoe sterk is die bewyse?

Die ontdekking self staan op vaste grond en is buitengewoon afgerond: dit berus op grootskaalse strukturele ontginning, dan op laboratoriumbevestiging van hoe die RNA gemaak word en hoe dit DNA vind en sny, dan op 'n byna-atomêre struktuur van die kompleks in aksie, plus die toets op menslike selle. Die bewering “dit is 'n nuwe, afsonderlike, RNA-geleide, DNA-teikenende familie” word gelyktydig uit verskeie rigtings goed ondersteun.

Wat vroeg is, is alles rondom bruikbaarheid: die redigering werk, maar net-net, en al die optimering wat CRISPR van 'n nuuskierigheid tot 'n hulpmiddel gemaak het, lê vir TIGR nog voor. En wat afleibaar is, is die res van die verhaal — die natuurlike rol is 'n redelike raaiskoot uit 'n kunsmatige eksperiment, en die evolusionêre skakel is, hoe elegant ook al, 'n argument uit gedeelde struktuur, nie 'n uitgemaakte geskiedenis nie. Die artikel is versigtig oor wat wat is.

Waarom dit saak maak

Verskeie vorige verbredings van die RNA-geleide katalogus het uiteindelik vrugte afgewerp. Die stelsels agter vandag se gereedskap — Cas9, Cas12, Cas13 en meer onlangs die kleiner IscB/OMEGA-proteïene en die eukariotiese Fanzors — was aanvanklik elk net nuut beskryfde biologie. Nie een het as 'n voltooide hulpmiddel aangekom nie. 'n Stelsel met 'n tweedelige gids en geen PAM-vereiste is 'n werklik ander vertrekpunt, en PAM-vrye teikening is presies die soort buigsaamheid wat hulpmiddelbouers waardeer.

Maar die stiller resultaat is dalk belangriker as die hulpmiddel-vooruitsig. Deur 'n DNA-snyende stelsel aan die RNA-redigerende snoRNP-masjinerie en aan 'n springende geen te koppel, skets die werk 'n moontlike draad wat baie verskillende RNA-geleide stelsels regoor die boom van die lewe verbind. Dit is die soort bevinding wat herorden hoe 'n vakgebied verstaan waar sy gereedskap vandaan kom — wat op die lang duur meer werd is as nog 'n opskrif oor skêre.

Helder opsomming

Deur na proteïen-vorme eerder as volgordes te soek, het navorsers TIGR-Tas ontdek: 'n voorheen onbekende familie van RNA-geleide, DNA-teikenende stelsels, meestal aangetref in bakteriële virusse en parasitiese bakterieë. Sy gids-RNA is ongewoon — ongeveer 36 letters met twee afsonderlike teikensegmente wat teenoorgestelde stringe van die DNA lees — en, anders as CRISPR, het dit geen aangrensende “PAM”-motief nodig nie. Die DNA-snyende lede sny presies, een kon geprogrammeer word om menslike selle te redigeer (hoewel net teen 'n doeltreffendheid van 'n paar persent), en 'n byna-atomêre struktuur het 'n kompleks onthul wat gebou is soos die snoRNP-masjinerie wat RNA in ons eie selle redigeer — wat dui op 'n diep evolusionêre skakel tussen RNA-geleide RNA-modifiserende en DNA-teikenende stelsels. Dit is 'n werklike uitbreiding van RNA-geleide biologie en 'n moontlike nuwe onderstel vir toekomstige gereedskap — 'n basiese-wetenskap-ontdekking en konsepbewys, nie 'n volwasse geen-redigeerder nie, nie “CRISPR 2.0” nie, en nie 'n terapie nie. Sy natuurlike taak in die natuur bly onbekend.

Padlangs-kontrole

Wat die artikel wys: 'n Nuwe, afsonderlike familie van RNA-geleide, DNA-teikenende stelsels (TIGR-Tas) in prokariote en hul virusse, gevind deur strukturele ontginning; 'n twee-segment, PAM-vrye gids-RNA (~36 nt) wat albei DNA-stringe in tandem teiken; presiese RNA-geleide DNA-splitsing deur die nuklease-draende lede; programmeerbare redigering in menslike selle teen lae doeltreffendheid (tot 'n paar persent); 'n byna-atomêre krio-EM-struktuur; en strukturele/evolusionêre skakels met boks C/D-snoRNP’s en IS110-transposons.

Wat aanneemlik is maar nie bewys nie: Die stelsels se natuurlike biologiese rol ('n nie-verdedigende rol in mededinging tussen mobiele elemente word deur een kunsmatige eksperiment voorgestel); die voorgestelde evolusionêre brug tussen RNA-modifiserende en DNA-teikenende RNA-geleide stelsels ('n strukturele argument).

Wat dit nie wys nie: 'n Volwasse of hoogdoeltreffende geen-redigeringshulpmiddel; meerderwaardigheid teenoor CRISPR as 'n hulpmiddel; 'n bevestigde natuurlike funksie; hoe die gids-RNA gerypmaak word; enige terapeutiese toepassing.

Vernaamste beperkings: Die redigeringsdoeltreffendheid in menslike selle is laag (slegs konsepbewys); die meeste stelsels leef in metagenome wat moeilik bestudeerbaar is, sodat die natuurlike teikens grootliks onbekend is; die bewerings oor die biologiese rol en die evolusionêre oorsprong is afleibaar; die karakterisering is in mikrobes en selkultuur, nie in enige siektekonteks nie.

Hoeveel vertroue behoort 'n algemene leser te hê? Hoog dat dit 'n egte, afsonderlike nuwe familie van RNA-geleide, DNA-teikenende stelsels is met 'n nuwe tweedelige, PAM-vrye meganisme, en dat die strukturele en evolusionêre insigte werklik is. Hoog dat dit nie 'n kant-en-klare geen-redigeringshulpmiddel is nie, nie “CRISPR 2.0” nie, en nie 'n terapie nie. Laag oor sy natuurlike rol en oor hoe ver dit as 'n hulpmiddel sal gaan. Gepaste houding: opregte opgewondenheid oor nuwe biologie en 'n moontlike ontbrekende skakel in die evolusie — en geduld met die toepassings, wat heel aan die begin is.