Një familje e re sistemesh të drejtuara nga RNA-ja që shënjestrojnë DNA-në — e dallueshme nga CRISPR dhe ende jo mjet për redaktim gjenesh

Një degë e re në pemën e makinave të drejtuara nga RNA-ja

Herë pas here një punim biologjie del në botë me një titull që nuk e ka kërkuar. Këtij i ra “një CRISPR i ri”. Puna pas tij është më interesante se kaq — dhe, si zakonisht, më modeste.

Nisemi nga ajo që CRISPR e bëri të famshme: një sistem i drejtuar nga RNA-ja. Truku është se proteina nuk ka nevojë të jetë e programuar në mënyrë të pandryshueshme për të njohur vetëm një objektiv. Ajo mban një copë të shkurtër RNA-je — një udhëzues — dhe shkon aty ku sekuenca e udhëzuesit përputhet. Ndrysho udhëzuesin, ndrysho objektivin. Pikërisht kjo programueshmëri e bëri CRISPR-in mjet. Por CRISPR nuk është i vetmi sistem i drejtuar nga RNA-ja në natyrë dhe pyetja e këtij punimi është më e durueshme: sa lloje të tjera ka dhe çfarë mund të na mësojnë?

Për t’i kërkuar, autorët nuk kërkuan sekuenca gjenesh që përputhen — ato ndryshojnë tepër gjatë evolucionit për të zbuluar të afërm shumë të largët. Ata kërkuan forma. Duke nisur nga pjesa e proteinës Cas9 të CRISPR-it që kap RNA-në udhëzuese, kërkuan në bazat e strukturave të parashikuara proteinike për gjëra të ndërtuara në mënyrë të ngjashme. Kjo gjurmë i çoi — përmes një “gjeni kërcyes” bakterial dhe një makinerie që qelizat e zakonshme përdorin për të modifikuar kimikisht RNA-në e tyre — te diçka vërtet e re.

Çfarë bënë autorët

Kërkimi strukturor zbuloi një familje proteinash të panjohur më parë, të koduara kryesisht në bakteriofagë (viruse që infektojnë bakteret), në viruse të arkeave dhe në baktere shumë të vogla parazitare. Secila ndodhet pranë një segmenti karakteristik DNA-je: një varg të gjatë përsëritës që autorët e quajtën array TIGR (Tandem Interspaced Guide RNA). Proteinat i quajtën Tas (TIGR-associated). Disa Tas kanë vetëm pjesën që kap RNA-në; të tjera kanë të bashkangjitur një mjet që pret DNA-në — një nga dy llojet e “gërshërëve” molekulare, RuvC ose HNH.

Pasi e gjetën familjen në bazat e të dhënave, e çuan në laborator: shprehën sistemet në E. coli dhe sekuencuan RNA-të e vogla që prodhonin, përcaktuan rregullat me të cilat këto RNA gjejnë një objektiv DNA-je, testuan nëse variantet me nukleazë vërtet presin, provuan ta programojnë njërin për të redaktuar qeliza njerëzore dhe, në fund, ngrinë një kompleks funksional dhe e imazhuan strukturën e tij me rezolucion afër atomit.

Çfarë gjetën

Udhëzuesi ka dy pjesë. Array-i TIGR përpunohet në RNA të shkurtra rreth 36 baza, secila me dy segmente të ndara shënjestrimi. Njëri lexon një fije të DNA-së objektiv; tjetri lexon fijen e kundërt. Të dy punojnë së bashku për ta fiksuar vendin. Kjo është një ndryshim real mekanistik nga CRISPR, ku udhëzuesi përputhet me një fije të vetme në një segment të vazhduar.

Dhe nuk ka nevojë për “platformë uljeje”. Shumë nukleaza CRISPR mund të presin vetëm pranë një motivi të shkurtër specifik DNA-je, PAM, që ndodhet ngjitur me objektivin — kufizim që zvogëlon numrin e vendeve ku mund të drejtohen. Sistemet TIGR nuk treguan një kërkesë të tillë: u mbështetën vetëm në sekuencën objektiv. Një sistem pa PAM, në parim, mund të drejtohet në më shumë vende.

Variantet me nukleazë presin me saktësi. Të udhëhequra nga RNA-ja e vogël, proteinat Tas me RuvC ose HNH bënë prerje të pastra dhe specifike për sekuencën në DNA — dhe pa udhëzues nuk bënë asgjë.

Një variant mund të programohej për të redaktuar qeliza njerëzore — mezi. Kur u fut në qeliza njerëzore në kulturë dhe u drejtua te gjashtë gjene të ndryshme, një proteinë Tas prodhoi redaktime, duke konfirmuar se sistemi është i programueshëm edhe në qelizat tona. Por efikasiteti ishte i ulët: në rastin më të mirë vetëm disa për qind e qelizave. Për krahasim, mjetet CRISPR të optimizuara sot redaktojnë zakonisht një pjesë të madhe të qelizave ku futen. Kjo provon se mund të funksionojë, jo se funksionon mirë si mjet.

Struktura shpjegoi mekanizmin — dhe dha një ide për origjinën. Kompleksi i imazhuar është një çift proteinash me simetri pasqyre që kapin RNA-në udhëzuese në formë tetëshe, ndërsa DNA-ja objektiv përkulet fort. Në mënyrë të habitshme, arkitektura ngjan shumë me një makineri të të afërmve të qelizave tona — box C/D “snoRNP” — që udhëheq modifikime kimike të RNA-së në vend që të presë DNA-në.

Puna e tij natyrore nuk dihet. Kur autorët shprehën një sistem në E. coli, ai nuk zmbrapsi viruse ose plazmide pushtuese — detyra tipike e CRISPR-it. Në vend të kësaj, gjatë shumë brezave e pastroi gradualisht një plazmid të shënjestruar, duke sugjeruar se roli i vërtetë mund të jetë konkurrenca e ngadaltë mes elementeve të lëvizshme të DNA-së, jo mbrojtja imunitare e vijës së parë. Por ky ishte një mjedis i huazuar dhe artificial; përgjigjja e ndershme është se ende askush nuk e di çfarë bëjnë këto sisteme në natyrë.

Çfarë do të thotë me gjasë

Dy gjëra, me nivele të ndryshme besimi.

E sigurta: bota e njohur e sistemeve të drejtuara nga RNA-ja është më e madhe dhe më e larmishme se CRISPR dhe të afërmit e zbuluar së fundmi. TIGR-Tas është degë vërtet e veçantë, me mënyrën e vet me dy segmente dhe pa PAM për njohjen e DNA-së. Kjo është shtesë reale në hartë.

Më e thella dhe më spekulative: për shkak se makineria TIGR ndërtohet si snoRNP që redakton RNA në qeliza si tonat dhe si një “gjen kërcyes” i njohur, ajo mund të shënojë një lidhje evolucionare mes sistemeve të drejtuara nga RNA-ja që modifikojnë RNA dhe atyre që shënjestrojnë DNA — një pjesë e mundshme që mungonte në historinë e udhëzuesve të programueshëm me RNA.

Çfarë nuk provon kjo

• Nuk është mjet i gatshëm për redaktim gjenesh. Redaktimi në qeliza njerëzore u demonstrua, por ishte i dobët — disa për qind në rastin më të mirë. Kjo është provë programueshmërie, jo editor i pjekur, dhe shumë larg çdo përdorimi klinik.
• Nuk është “CRISPR 2.0”. Si mjet sot, CRISPR-Cas9 e tejkalon shumë në efikasitet. TIGR-Tas është një arkitekturë e re në fazën proof-of-concept, jo version më i mirë i një produkti ekzistues.
• Roli biologjik është i panjohur. Në testin e vetëm për këtë ide nuk u soll si sistem imunitar antiviral; “një sistem i ri imunitar bakterial” nuk është vendosur.
• Shumë nga mekanizmi bazë mbetet i hapur — përfshirë mënyrën si RNA-ja udhëzuese pritet në gjatësinë përfundimtare dhe çfarë shënjestrojnë këto sisteme në natyrë (shumica jetojnë në mikrobe që mezi mund t’i kultivojmë).
• Nuk ka asgjë terapeutike këtu. Është zbulim dhe karakterizim në mikrobe dhe kulturë qelizore — pa sëmundje, pa trajtim, pa pacient.

Sa e fortë është prova?

Vetë zbulimi qëndron në bazë të fortë dhe është jashtëzakonisht i plotë: nis nga kërkimi strukturor në shkallë të madhe, vazhdon me konfirmim laboratorik të mënyrës si prodhohet RNA-ja dhe si gjen e pret DNA-në, pastaj me strukturë afër atomit të kompleksit në veprim dhe me testin në qeliza njerëzore. Pretendimi “kjo është një familje e re, e dallueshme, e sistemeve të drejtuara nga RNA-ja që shënjestrojnë DNA-në” mbështetet nga disa drejtime njëherësh.

Ajo që është e hershme është çdo gjë për dobishmërinë: redaktimi funksionon, por mezi, dhe gjithë optimizimi që e ktheu CRISPR-in nga kuriozitet në mjet për TIGR-in ende nuk ka filluar. Ajo që është e nxjerrë me inferencë është pjesa tjetër e historisë — roli natyror është një hamendësim i arsyeshëm nga një eksperiment artificial, ndërsa lidhja evolucionare, sado elegante, është argument nga struktura e përbashkët, jo histori e vendosur. Punimi i ndan me kujdes këto nivele.

Pse ka rëndësi

Zgjerime të mëparshme të katalogut të sistemeve të drejtuara nga RNA-ja përfundimisht kanë dhënë mjete të vlefshme. Sistemet pas mjeteve të sotme — Cas9, Cas12, Cas13 dhe më së fundmi proteinat më të vogla IscB/OMEGA dhe Fanzor-et eukariote — në fillim ishin thjesht biologji e sapopërshkruar. Asnjë nuk erdhi si mjet i përfunduar. Një sistem me udhëzues dy-pjesësh dhe pa kërkesë PAM është një pikënisje vërtet e ndryshme, dhe shënjestrimi pa PAM është pikërisht lloji i fleksibilitetit që vlerësojnë ndërtuesit e mjeteve.

Por rezultati më i qetë mund të ketë më shumë rëndësi se perspektiva e mjetit. Duke lidhur një sistem që pret DNA-në me makinerinë snoRNP që redakton RNA-në dhe me një gjen kërcyes, puna skicon një fije të mundshme që bashkon sisteme shumë të ndryshme të drejtuara nga RNA-ja në pemën e jetës. Është lloj zbulimi që riorganizon mënyrën si një fushë e kupton prejardhjen e mjeteve të veta — dhe, në afat të gjatë, kjo vlen më shumë se një titull tjetër për “gërshërë”.

Përmbledhje e shkurtër

Duke kërkuar forma proteinash dhe jo sekuenca, studiuesit zbuluan TIGR-Tas: një familje të panjohur më parë sistemesh të drejtuara nga RNA-ja që shënjestrojnë DNA-në, të gjetura kryesisht në viruse bakteriale dhe baktere parazitare. RNA-ja udhëzuese është e pazakontë — rreth 36 baza me dy segmente shënjestrimi që lexojnë fijet e kundërta të DNA-së — dhe, ndryshe nga CRISPR, nuk ka nevojë për motiv PAM ngjitur me objektivin. Anëtarët me nukleazë presin DNA-në me saktësi; njëri mund të programohej për të redaktuar qeliza njerëzore, por vetëm me efikasitet disa për qind; dhe një strukturë afër atomit tregoi një kompleks të ndërtuar ngjashëm me makinerinë snoRNP që redakton RNA në qelizat tona, duke sugjeruar një lidhje të thellë evolucionare mes sistemeve që modifikojnë RNA dhe atyre që shënjestrojnë DNA. Është zgjerim real i biologjisë së drejtuar nga RNA-ja dhe një shasi e mundshme për mjete të ardhshme — zbulim i shkencës bazë dhe proof of concept, jo editor gjenesh i pjekur, jo “CRISPR 2.0” dhe jo terapi. Funksioni natyror mbetet i panjohur.

Kontroll pa teprime

Çfarë tregon punimi: Një familje të re dhe të dallueshme sistemesh TIGR-Tas që shënjestrojnë DNA-në me RNA në prokariote dhe viruset e tyre, e gjetur përmes kërkimit strukturor; një RNA udhëzuese me dy segmente dhe pa PAM (~36 nt) që shënjestron të dy fijet e DNA-së në tandem; prerje të saktë të DNA-së të drejtuar nga RNA-ja; redaktim të programueshëm në qeliza njerëzore me efikasitet të ulët; strukturë cryo-EM afër atomit; dhe lidhje strukturore/evolucionare me box C/D snoRNP dhe transpozonet IS110.

Çfarë është e besueshme, por jo e provuar: Roli biologjik natyror i sistemeve (një rol jo-mbrojtës në konkurrencën mes elementeve të lëvizshme sugjerohet nga një eksperiment artificial); ura evolucionare e propozuar mes sistemeve që modifikojnë RNA dhe atyre që shënjestrojnë DNA (argument strukturor).

Çfarë nuk tregon: Një editor gjenesh të pjekur ose me efikasitet të lartë; epërsi ndaj CRISPR-it si mjet; funksion natyror të konfirmuar; mënyrën si piqet RNA-ja udhëzuese; ndonjë aplikim terapeutik.

Kufizimet kryesore: Efikasiteti i redaktimit në qeliza njerëzore është i ulët (vetëm proof of concept); shumica e sistemeve gjenden në metagjenome të vështira për t’u studiuar, ndaj objektivat natyrore janë kryesisht të panjohura; pretendimet për rolin biologjik dhe origjinën evolucionare janë inferenciale; karakterizimi është bërë në mikrobe dhe kulturë qelizore, jo në kontekst sëmundjeje.

Sa besim duhet të ketë një lexues i përgjithshëm? Të lartë se kjo është vërtet një familje e re dhe e veçantë sistemesh të drejtuara nga RNA-ja që shënjestrojnë DNA-në, me mekanizëm të ri dy-pjesësh dhe pa PAM, dhe se njohuritë strukturore/evolucionare janë reale. Të lartë gjithashtu se nuk është një mjet i gatshëm, nuk është “CRISPR 2.0” dhe nuk është terapi. Të ulët për rolin natyror dhe për sa larg do të shkojë si mjet. Qëndrimi i duhur: entuziazëm i arsyeshëm për biologjinë e re dhe një lidhje të mundshme evolucionare — dhe durim për aplikimet, që sapo kanë filluar.