Jauna RNS vadītu DNS mērķējošu sistēmu ģimene — atšķirīga no CRISPR un vēl ne gēnu rediģēšanas rīks

Jauns zars RNS vadīto molekulāro mašīnu kokā

Ik pa laikam bioloģijas raksts nonāk ziņās ar virsrakstu, ko pats nekad nav prasījis. Šoreiz tas bija „jauns CRISPR”. Patiesais darbs ir interesantāks — un, kā parasti, pieticīgāks.

Sāksim ar to, ko CRISPR padarīja slavenu: RNS vadītu sistēmu. Olbaltumvielai nav jābūt iepriekš „ieprogrammētai”, lai tā atpazītu vienu konkrētu mērķi. Tā nes īsu RNS fragmentu — vadotni — un saistās tur, kur vadotnes secība sakrīt ar mērķi. Maini vadotni, maini mērķi. Tieši šī programmējamība padarīja CRISPR par instrumentu. Taču CRISPR nav vienīgā RNS vadītā sistēma dabā, un šis raksts uzdod pacietīgāku jautājumu: cik daudz citu veidu pastāv un ko tie mums var iemācīt?

Meklējumos autori nebalstījās uz līdzīgām gēnu sekvencēm — evolūcijas laikā tās var mainīties tik stipri, ka tāli radinieki vairs nav atpazīstami. Viņi meklēja formas. Sākot ar Cas9 olbaltumvielas daļu, kas satver vadotnes RNS, pētnieki izsijāja paredzēto olbaltumvielu struktūru datubāzes, meklējot līdzīgas uzbūves. Šis ceļš — caur baktēriju „lēcošu gēnu” un mehānismu, ko parastas šūnas izmanto savas RNS ķīmiskai modificēšanai — noveda pie patiesi jaunas sistēmas.

Ko autori darīja

Struktūru meklēšana atklāja iepriekš neatzītu olbaltumvielu ģimeni, ko galvenokārt kodē bakteriofāgi (baktēriju vīrusi), arheju vīrusi un sīkas parazītiskas baktērijas. Blakus katram gēnam atrodas raksturīgs DNS posms — garš atkārtojumu masīvs, ko autori nosauca par TIGR masīvu (Tandem Interspaced Guide RNA). Olbaltumvielas viņi nosauca par Tas (TIGR-associated). Daļa Tas olbaltumvielu satur tikai RNS saistošo kodolu; citām pievienots DNS griešanas domēns — viens no diviem molekulāro „šķēru” tipiem, RuvC vai HNH.

Pēc ģimenes atrašanas datubāzēs autori to pārbaudīja laboratorijā. Sistēmas tika ekspresētas E. coli, tika sekvenētas to radītās mazās RNS, noskaidroti noteikumi, pēc kuriem RNS atrod DNS mērķi, pārbaudīts, vai nukleāzes tiešām griež DNS, viena sistēma tika programmēta cilvēka šūnu rediģēšanai, un visbeidzot aktīvs komplekss tika sasaldēts un attēlots gandrīz atomārā izšķirtspējā.

Ko viņi atklāja

Vadotnei ir divas mērķējošas daļas. TIGR masīvs tiek apstrādāts īsās, aptuveni 36 nukleotīdus garās RNS, un katrā ir divi atsevišķi mērķējoši segmenti. Viens nolasa vienu mērķa DNS virkni, otrs — pretējo. Abi darbojas kopā, lai nostiprinātu kompleksu konkrētā vietā. Tas ir īsts mehānisks atšķirības punkts no CRISPR, kur vadotne parasti vienā nepārtrauktā posmā pārojas ar vienu virkni.

Nav vajadzīga blakus esoša „nosēšanās vieta”. Daudzas CRISPR nukleāzes spēj griezt tikai tad, ja blakus mērķim atrodas īss specifisks DNS motīvs — PAM. Tas ierobežo vietas, uz kurām tās var mērķēt. TIGR sistēmām šāda prasība netika konstatēta: tās balstījās uz paša mērķa secību. Sistēmu bez PAM principā varētu vērst uz plašāku vietu klāstu.

Nukleāzes grieza precīzi. RNS vadītas Tas olbaltumvielas ar RuvC vai HNH domēnu radīja tīrus, secībai specifiskus DNS pārrāvumus — un bez vadotnes negrieza.

Vienu variantu varēja ieprogrammēt cilvēka šūnās — taču ļoti neefektīvi. Sistēmu ievietoja kultivētās cilvēka šūnās un vērsa uz sešiem dažādiem gēniem. Rediģēšana tiešām notika, pierādot programmējamību arī mūsu šūnās, taču efektivitāte bija zema — labākajā gadījumā daži procenti šūnu. Salīdzinājumam, mūsdienu optimizētie CRISPR rīki bieži rediģē lielu daļu apstrādāto šūnu. Tas pierāda, ka sistēma var darboties, nevis ka tā darbojas labi.

Struktūra izskaidroja mehānismu un deva mājienu par izcelsmi. Attēlotais komplekss ir spoguļsimetrisks olbaltumvielu pāris, kas satver astoņnieka formas vadotnes RNS, bet mērķa DNS tiek saliekta asā pagriezienā. Pārsteidzoši, šī arhitektūra stipri atgādina box C/D snoRNP — mehānismu, ko mūsu šūnu radinieki izmanto RNS ķīmiskai modificēšanai, nevis DNS griešanai.

Dabiskā funkcija vēl nav skaidra. Kad autori vienu sistēmu ekspresēja E. coli, tā neaizsargāja pret iebrūkošiem vīrusiem vai plazmīdām — tas būtu CRISPR tipiskais „dienas darbs”. Tā vietā mērķētā plazmīda daudzu paaudžu laikā pakāpeniski izzuda, kas varētu norādīt uz lomu lēnā konkurencē starp mobilajiem DNS elementiem, nevis akūtā pretvīrusu aizsardzībā. Taču tas bija mākslīgs, aizgūts eksperimentāls konteksts, un godīgā atbilde ir: mēs vēl nezinām, ko šīs sistēmas dara dabā.

Ko tas, visticamāk, nozīmē

Divas lietas ar atšķirīgu pārliecības līmeni.

Stiprākais secinājums: RNS vadīto sistēmu pasaule ir lielāka un daudzveidīgāka par CRISPR un tā nesen atklātajiem radiniekiem. TIGR-Tas ir patiesi atšķirīgs zars ar savu divdaļīgu, no PAM neatkarīgu DNS atpazīšanas mehānismu. Tas ir reāls papildinājums bioloģijas kartei.

Dziļākais un spekulatīvākais secinājums: tā kā TIGR mehānisma uzbūve atgādina gan šūnu RNS modificējošo snoRNP, gan zināmu „lēcošu gēnu”, tas varētu iezīmēt evolūcijas saikni starp RNS vadītām RNS modificēšanas sistēmām un RNS vadītām DNS mērķēšanas sistēmām — iespējamu trūkstošu posmu stāstā par to, kā programmējamas RNS vadotnes izveidojās dažādās dzīvības līnijās.

Ko tas nepierāda

• Tā nav gatava gēnu rediģēšanas sistēma. Rediģēšana cilvēka šūnās tika demonstrēta, bet bija vāja — labākajā gadījumā daži procenti. Tas pierāda programmējamību, nevis nobriedušu rīku, un līdz klīniskam lietojumam ir ļoti tālu.
• Tā nav „CRISPR 2.0”. Kā rīks šodien CRISPR-Cas9 to ievērojami pārspēj. TIGR-Tas ir jauna arhitektūra koncepcijas pierādījuma stadijā, nevis uzlabota gatava produkta versija.
• Sistēmas bioloģiskā funkcija nav zināma. Vienā pārbaudē tā nedarbojās kā pretvīrusu imūnsistēma, tāpēc „jauna baktēriju imūnsistēma” nav pierādīta.
• Daļa pamatmehānisma joprojām nav noskaidrota — tostarp, kā vadotnes RNS iegūst galīgo garumu un ko šīs sistēmas dabā patiesībā mērķē. Liela daļa atrodama organismos, kurus ir grūti kultivēt.
• Šeit nav terapijas. Tas ir mikrobu un šūnu kultūru pamatpētījums, nevis slimības vai pacientu ārstēšanas darbs.

Cik pārliecinoši ir pierādījumi?

Pats atklājums ir labi pamatots un neparasti daudzpusīgi pārbaudīts: liela mēroga struktūru meklēšanai sekoja laboratorijas apstiprinājums tam, kā veidojas RNS un kā tā atrod un griež DNS, tad gandrīz atomāra aktīvā kompleksa struktūra un arī cilvēka šūnu tests. Apgalvojumu „šī ir jauna, atšķirīga RNS vadīta DNS mērķējoša sistēmu ģimene” atbalsta vairāki neatkarīgi pierādījumu veidi.

Agrīnā stadijā ir viss, kas saistīts ar praktisko lietojumu. Rediģēšana darbojas, bet vāji, un visa optimizācija, kas CRISPR pārvērta no bioloģiska kurioza par rīku, TIGR gadījumā vēl ir priekšā. Vēl vairāk interpretācijas vajadzīgs pārējam stāstam: dabiskā funkcija ir saprātīgs minējums no mākslīga eksperimenta, bet evolūcijas saikne, lai arī eleganta, ir arguments no kopīgas struktūras, nevis noslēgta vēsture. Raksts šīs pārliecības pakāpes rūpīgi nošķir.

Kāpēc tas ir svarīgi

Vairāki iepriekšējie RNS vadīto sistēmu kataloga paplašinājumi ar laiku kļuvuši praktiski vērtīgi. Cas9, Cas12, Cas13, mazākās IscB/OMEGA olbaltumvielas un eikariotu Fanzor sistēmas sākumā visas bija vienkārši jauna bioloģija. Neviena neieradās kā gatavs instruments. Sistēma ar divdaļīgu vadotni un bez PAM prasības ir patiesi atšķirīgs sākumpunkts, un mērķēšana bez PAM ir tieši tāda elastība, ko rīku veidotāji novērtē.

Taču klusākais rezultāts var izrādīties svarīgāks par rīka perspektīvu. Saistot DNS griešanas sistēmu ar RNS modificējošo snoRNP mehānismu un ar „lēcošu gēnu”, darbs iezīmē iespējamu pavedienu, kas savieno ļoti atšķirīgas RNS vadītās sistēmas dzīvības evolūcijas kokā. Šāda veida atradums var pārkārtot izpratni par to, no kurienes nākuši mūsu rīki — un ilgtermiņā tas var būt vērtīgāk nekā vēl viens virsraksts par molekulārajām šķērēm.

Īss kopsavilkums

Meklējot olbaltumvielu formas, nevis tikai secību līdzību, pētnieki atklāja TIGR-Tas — iepriekš nezināmu RNS vadītu DNS mērķējošu sistēmu ģimeni, kas sastopama galvenokārt baktēriju vīrusos un parazītiskās baktērijās. Tās vadotnes RNS ir neparasta: aptuveni 36 nukleotīdu gara un satur divus atsevišķus segmentus, kas atpazīst pretējās DNS virknes. Atšķirībā no CRISPR tai nav vajadzīgs blakus esošs PAM motīvs. Nukleāzes tipa locekļi precīzi griež DNS, vienu variantu varēja ieprogrammēt cilvēka šūnu rediģēšanai — gan tikai ar dažu procentu efektivitāti —, un gandrīz atomāra struktūra atklāja līdzību ar snoRNP mehānismu, kas mūsu šūnās modificē RNS. Tas norāda uz iespējamu dziļu evolūcijas saikni starp RNS vadītu RNS modificēšanu un DNS mērķēšanu. TIGR-Tas ir īsts RNS vadītās bioloģijas paplašinājums un potenciāls sākumpunkts nākotnes rīkiem — pamatpētījuma atklājums un koncepcijas pierādījums, nevis nobriedis gēnu redaktors, „CRISPR 2.0” vai terapija. Tā dabiskā funkcija joprojām nav zināma.

Bez pārspīlējumiem

Ko raksts parāda: jaunu, atšķirīgu RNS vadītu DNS mērķējošu sistēmu ģimeni TIGR-Tas prokariotos un to vīrusos, atrastu ar struktūru meklēšanu; divdaļīgu, no PAM neatkarīgu ~36 nt vadotnes RNS, kas tandēmā mērķē abas DNS virknes; precīzu RNS vadītu DNS šķelšanu nukleāzes saturošajos variantos; programmējamu, bet zemas efektivitātes rediģēšanu cilvēka šūnās; gandrīz atomāru krio-EM struktūru; strukturālas un evolūcijas saites ar box C/D snoRNP un IS110 transpozoniem.

Kas ir ticams, bet nav pierādīts: sistēmu dabiskā bioloģiskā loma — viens mākslīgs eksperiments norāda uz iespējamu lomu mobilo elementu konkurencē, nevis aizsardzībā; piedāvātais evolūcijas tilts starp RNS modificējošām un DNS mērķējošām RNS vadītām sistēmām ir strukturāls arguments.

Ko tas neparāda: nobriedušu vai augstas efektivitātes gēnu rediģēšanas rīku; pārākumu pār CRISPR; apstiprinātu dabisko funkciju; vadotnes RNS nobriešanas mehānismu; terapeitisku lietojumu.

Galvenie ierobežojumi: rediģēšana cilvēka šūnās ir zemas efektivitātes koncepcijas pierādījums; vairums sistēmu atrodas grūti pētāmos metagenomos, tāpēc dabiskie mērķi lielākoties nav zināmi; dabiskās funkcijas un evolūcijas izcelsmes secinājumi ir inferenciāli; raksturojums veikts mikrobos un šūnu kultūrā, nevis slimību kontekstā.

Cik lielai jābūt lasītāja pārliecībai? Augstai, ka tā ir īsta un atšķirīga RNS vadītu DNS mērķējošu sistēmu ģimene ar jaunu divdaļīgu, no PAM neatkarīgu mehānismu. Augstai arī par to, ka tas nav gatavs gēnu rediģēšanas rīks, „CRISPR 2.0” vai terapija. Zemai par dabisko funkciju un to, cik tālu sistēma nonāks kā instruments. Pareizā attieksme: pamatots entuziasms par jaunu bioloģiju un iespējamu evolūcijas trūkstošo posmu — un pacietība attiecībā uz pielietojumiem, kas ir pašā sākumā.