Ný grein á ættartré RNA-stýrðra véla

Ný grein á ættartré RNA-stýrðra véla

Öðru hverju birtist líffræðigrein með fyrirsögn sem hún bað aldrei um. Fyrirsögn þessarar varð „nýtt CRISPR“. Vinnan á bak við hana er áhugaverðari en það — og, eins og svo oft, hófstilltari.

Byrjum á því sem gerði CRISPR frægt: RNA-stýrðu kerfi. Hugmyndin er að próteinið þarf ekki að vera varanlega forritað til að þekkja eitt tiltekið skotmark. Í staðinn ber það stutt RNA-brot — leiðar-RNA — og fer þangað sem röð leiðarans passar við markröðina. Breytið leiðaranum og skotmarkið breytist. Þessi forritanleiki er meginástæðan fyrir því að CRISPR varð verkfæri. En CRISPR er ekki eina RNA-stýrða kerfið í náttúrunni, og spurning greinarinnar er þolinmóðari: hversu margar aðrar gerðir eru til, og hvað geta þær kennt okkur?

Til að leita að slíkum kerfum leituðu höfundarnir ekki að samsvarandi genaröðum — þær geta breyst of mikið á löngum þróunartíma til að fjarskyld tengsl sjáist. Þeir leituðu að lögun. Þeir byrjuðu á þeim hluta Cas9-próteins CRISPR sem heldur utan um leiðar-RNA-ið og leituðu í gagnagrunnum yfir spáð próteinform að öðrum próteinum með svipaða byggingu. Slóðin leiddi — í gegnum bakteríu-„stökkgen“ og sameindavél sem venjulegar frumur nota til að efnafræðilega breyta eigin RNA — að einhverju sem virtist raunverulega nýtt.

Hvað gerðu höfundarnir?

Byggingarleitin fann áður óþekkta próteinfjölskyldu, aðallega skráða í bakteríuveirum, veirum fornbaktería og mjög litlum sníkjubakteríum. Við hlið hvers slíks gens er sérstakt DNA-svæði: löng endurtekin röð sem höfundarnir nefndu TIGR-fylki (Tandem Interspaced Guide RNA). Próteinin kölluðu þeir Tas (TIGR-associated). Sum Tas-prótein eru nær eingöngu RNA-bindihlutinn; önnur bera DNA-klippandi ensím — annaðhvort RuvC eða HNH — sem hluta af sömu sameind.

Eftir að fjölskyldan fannst í gagnagrunnunum fóru höfundarnir með kerfin inn á rannsóknarstofu. Þeir tjáðu þau í E. coli, raðgreindu litlu RNA-sameindirnar sem urðu til, fundu reglurnar sem láta RNA-ið finna DNA-skotmark, prófuðu hvort klippandi útgáfurnar klipptu í raun, reyndu að forrita eina þeirra til að breyta mannafrumum og frystu að lokum virkt sameindaflókaástand til að mynda bygginguna með nær-atómupplausn.

Hvað fundu þeir?

Leiðar-RNA-ið kemur í tveimur hlutum. TIGR-fylkið er unnið niður í stutt RNA, um 36 kirni, og hvert þeirra hefur tvö aðskilin marksvæði. Annað les annan DNA-þráðinn, hitt þann gagnstæða. Saman festa þau kerfið við ákveðinn stað. Þetta er raunverulegur vélrænn munur frá CRISPR, þar sem leiðar-RNA passar við einn þráð í einni samfelldri röð.

Og það þarf ekkert „lendingarsvæði“. Margar CRISPR-kjarnsýrur geta aðeins klippt ef stutt, ákveðið DNA-mótíf — PAM — liggur rétt við skotmarkið. Það takmarkar hvaða staði þær geta miðað á. TIGR-kerfin sýndu enga slíka kröfu: þau treystu aðeins á sjálfa markröðina. Kerfi án PAM-kröfu er, að minnsta kosti í meginatriðum, hægt að beina að fleiri stöðum.

Klippandi útgáfurnar klipptu nákvæmlega. Með leiðar-RNA-inu mynduðu Tas-prótein með RuvC- eða HNH-hneppi skýr, raðsértæk brot í DNA — en klipptu ekki án leiðarans.

Ein útgáfa gat breytt mannafrumum — en aðeins lítillega. Þegar Tas-prótein var sett í mannafrumur í rækt og beint að sex mismunandi genum myndaði það breytingar. Það staðfestir að kerfið er forritanlegt líka í frumum okkar. En skilvirknin var lág: í besta falli nokkur prósent frumna. Til samanburðar geta vel þróuð CRISPR-verkfæri nú breytt stórum hluta frumna sem þau eru sett í. Þetta sýnir að kerfið getur virkað, ekki að það virki vel.

Byggingin útskýrði verkunina — og gaf vísbendingu um upprunann. Myndaður flókinn er spegilsamhverft par próteina sem heldur utan um átta-laga leiðar-RNA, á meðan mark-DNA-ið beygist í hvassan boga. Athyglisvert er að byggingin líkist mjög box C/D snoRNP-sameindavél sem finnst í frumulínum skyldum okkar og stýrir efnafræðilegum breytingum á RNA frekar en DNA-klippingu.

Náttúrulegt hlutverk kerfisins er óljóst. Þegar höfundarnir tjáðu eitt kerfi í E. coli varði það bakteríuna ekki gegn innrásarveirum eða plasmíðum — það sem CRISPR gerir oft í náttúrunni. Í staðinn hvarf merkt plasmíð smám saman úr stofninum yfir margar kynslóðir. Það gæti bent til hlutverks í hægri samkeppni milli hreyfanlegra DNA-eininga frekar en beinni ónæmisvörn. En tilraunin fór fram í aðfluttu, tilbúnu samhengi. Hreina svarið er að við vitum ekki enn hvað þessi kerfi gera í náttúrunni.

Hvað þýðir þetta líklega?

Tvær niðurstöður, með ólíku öryggi.

Sú trausta er að heimur RNA-stýrðra kerfa er stærri og fjölbreyttari en CRISPR og nýfundnir ættingjar þess. TIGR-Tas er raunverulega sérstök grein með eigin tveggja-hluta, PAM-lausri aðferð til að þekkja DNA. Það bætir nýju svæði við kortið.

Dýpri og óvissari túlkunin er að vegna þess að TIGR-vélin er byggð svipað og snoRNP-kerfið sem breytir RNA í frumum eins og okkar, og líka líkt þekktu stökkgeni, gæti hún verið þróunarlegt tengslastig milli RNA-stýrðra kerfa sem breyta RNA og þeirra sem miða á DNA. Það gæti verið hluti af sögunni um hvernig forritanleg RNA-leiðsögn þróaðist víða í lífríkinu.

Hvað sýnir þetta ekki?

• Þetta er ekki tilbúið genabreytingatæki. Breytingar í mannafrumum voru sýndar, en með mjög lítilli skilvirkni — fáein prósent í besta falli. Það er sönnun á forritanleika, ekki þroskaður ritill og langt frá klínískri notkun.
• Þetta er ekki „CRISPR 2.0“. Sem verkfæri í dag er CRISPR-Cas9 mun skilvirkara. TIGR-Tas er ný byggingargerð á sönnunarstigi, ekki betri útgáfa af núverandi vöru.
• Líffræðilegt hlutverk þess er óþekkt. Í einu prófi hegðaði kerfið sér ekki eins og veiruvörn; því er ekki staðfest að þetta sé „nýtt bakteríuónæmiskerfi“.
• Margt í grunnverkuninni er enn óþekkt — þar á meðal hvernig leiðar-RNA-ið er klippt í lokastærð og hver náttúruleg skotmörk kerfanna eru. Mörg þeirra finnast í örverum sem erfitt er að rækta.
• Hér er engin meðferð. Þetta er uppgötvun og lýsing á kerfum í örverum og frumurækt — enginn sjúkdómur, engin meðferð, engir sjúklingar.

Hversu sterk eru gögnin?

Sjálf uppgötvunin stendur á traustum grunni og er óvenju vel studd frá mörgum áttum: stórfelld leit í próteinbyggingum, tilraunastaðfesting á því hvernig RNA myndast og finnur og klippir DNA, nær-atómbygging virks flóka og síðan próf í mannafrumum. Fullyrðingin „þetta er ný og aðgreind fjölskylda RNA-stýrðra DNA-markkerfa“ er því vel studd.

Það sem er mjög snemma á vegi statt er allt sem snýr að notagildi. Breytingarnar virka en illa, og öll sú fínstilling sem breytti CRISPR úr líffræðilegri forvitni í verkfæri er enn óunnin fyrir TIGR. Það sem er ályktað fremur en sýnt er afgangurinn af sögunni: náttúrulegt hlutverk er skynsamleg tilgáta byggð á tilbúnu prófi, og þróunartengingin er rök byggð á sameiginlegri byggingu, ekki endanlega rakin saga. Greinin gerir greinarmun á þessu.

Hvers vegna skiptir þetta máli?

Fyrri stækkanir á safni RNA-stýrðra kerfa hafa síðar skilað sér. Kerfin á bak við Cas9, Cas12 og Cas13, og síðar smærri IscB/OMEGA-prótein og Fanzor-kerfi heilkjörnunga, byrjuðu öll sem nýlýst líffræði. Ekkert þeirra kom tilbúið sem verkfæri. Kerfi með tveggja-hluta leiðara og án PAM-kröfu er því raunverulega annar upphafspunktur, og PAM-laus miðun er nákvæmlega sú sveigjanleiki sem verkfærahönnuðir meta.

En rólegri niðurstaðan gæti skipt meira máli en framtíðarverkfærið. Með því að tengja DNA-klippandi kerfi við RNA-breytandi snoRNP-vél og stökkgen dregur greinin upp hugsanlegan þráð milli mjög ólíkra RNA-stýrðra kerfa á ættartré lífsins. Slík uppgötvun getur breytt því hvernig fræðigrein skilur uppruna eigin verkfæra — og til lengri tíma er það meira virði en enn ein fyrirsögn um „sameindaskæri“.

Í stuttu máli

Með því að leita að lögun próteina frekar en röðum fundu vísindamenn TIGR-Tas: áður óþekkta fjölskyldu RNA-stýrðra DNA-markkerfa, aðallega í bakteríuveirum og sníkjubakteríum. Leiðar-RNA-ið er óvenjulegt — um 36 kirni með tveimur aðskildum marksvæðum sem lesa gagnstæða DNA-þræði — og ólíkt CRISPR þarf kerfið ekkert aðliggjandi PAM-mótíf. Klippandi meðlimir fjölskyldunnar gera nákvæm DNA-brot, hægt var að forrita eina útgáfu til að breyta mannafrumum, þó aðeins með fáeinna prósenta skilvirkni, og nær-atómbygging sýndi flóka sem líkist snoRNP-vélinni sem breytir RNA í frumum okkar. Það bendir til mögulegra djúpra þróunartengsla milli RNA-stýrðra RNA-breytinga og DNA-markkerfa. Þetta er raunveruleg útvíkkun á þekktri RNA-stýrðri líffræði og mögulegur grunnur að framtíðarverkfærum — grunnrannsókn og sönnun á hugmynd, ekki þroskaður genaritill, ekki „CRISPR 2.0“ og ekki meðferð. Náttúrulegt hlutverk kerfisins er enn óþekkt.

Raunhæf yfirferð

Það sem greinin sýnir: Nýja og aðgreinda fjölskyldu RNA-stýrðra DNA-markkerfa, TIGR-Tas, í dreifkjörnungum og veirum þeirra, fundna með byggingarleit; tveggja-hluta, PAM-laust leiðar-RNA (~36 nt) sem miðar á báða DNA-þræði; nákvæma RNA-stýrða DNA-klippingu hjá kjarnsýruberandi meðlimum; forritanlegar breytingar í mannafrumum með lágri skilvirkni; nær-atóm cryo-EM-byggingu; og byggingar-/þróunartengsl við box C/D snoRNP og IS110-transpósóna.

Það sem er líklegt en ekki sannað: Náttúrulegt líffræðilegt hlutverk kerfanna; eitt tilbúið próf bendir til hlutverks í samkeppni hreyfanlegra erfðaefniseininga fremur en vörnum. Einnig er þróunarbrúin milli RNA-breytandi og DNA-markandi kerfa rökstudd með byggingu, en ekki endanlega staðfest saga.

Það sem greinin sýnir ekki: Þroskað eða mjög skilvirkt genabreytingatæki; yfirburði yfir CRISPR; staðfest náttúrulegt hlutverk; nákvæma þroskun leiðar-RNA-sameindarinnar; eða nokkra lækningalega notkun.

Helstu takmarkanir: Skilvirkni í mannafrumum er lág og aðeins sönnun á hugmynd; flest kerfin koma úr metagenómgögnum og náttúruleg skotmörk eru lítt þekkt; túlkanir á líffræðilegu hlutverki og þróunaruppruna eru ályktanir; rannsóknin er í örverum og frumurækt, ekki sjúkdómslíkani.

Hversu mikið traust ætti almennur lesandi að bera til niðurstöðunnar? Mikið traust á því að TIGR-Tas sé raunverulega ný fjölskylda RNA-stýrðra DNA-markkerfa með nýstárlegri tveggja-hluta, PAM-lausri verkun, og að byggingarniðurstöðurnar séu raunverulegar. Einnig mikið traust á því að þetta sé ekki tilbúið genaverkfæri, ekki „CRISPR 2.0“ og ekki meðferð. Mun minna traust á náttúrulegu hlutverki þess og því hversu langt það mun komast sem verkfæri. Rétt afstaða er raunveruleg spenna yfir nýrri líffræði — og þolinmæði gagnvart notkuninni, sem er rétt að byrja.