Новае сямейства РНК-накіраваных сістэм нацэльвання на ДНК — адрознае ад CRISPR і пакуль не інструмент рэдагавання генаў

Новая галіна на дрэве РНК-накіраваных машын

Час ад часу выходзіць біялагічны артыкул, якому прыпісваюць загаловак, пра які ён ніколі не прасіў. Гэтым разам гэта быў «новы CRISPR». Праца за гэтым загалоўкам цікавейшая — і, як звычайна, сціплейшая.

Пачнём з таго, чым праславіўся CRISPR: з РНК-накіраванай сістэмы. Яе хітрасць у тым, што бялок не абавязкова павінен быць жорстка «запраграмаваны» на распазнаванне адной мішэні. Замест гэтага ён нясе кароткі фрагмент РНК — гід — і накіроўваецца туды, дзе паслядоўнасць гэтага гіда супадае з мішэнню. Змяніце гід — зменіцца і мішэнь. Менавіта гэтая праграмуемасць ператварыла CRISPR у інструмент. Але CRISPR — не адзіная РНК-накіраваная сістэма ў прыродзе, і гэтая праца задае цярплівае пытанне: колькі іншых тыпаў такіх сістэм існуе і чаму яны могуць нас навучыць?

Каб шукаць такія сістэмы, аўтары не спрабавалі знаходзіць падобныя генныя паслядоўнасці — за эвалюцыйны час яны змяняюцца занадта моцна, каб па іх упэўнена распазнаваць далёкіх сваякоў. Яны шукалі формы. Узяўшы за адпраўную кропку частку бялку Cas9 сістэмы CRISPR, якая ўтрымлівае гідавую РНК, даследчыкі прачасалі базы прадказаных бялковых структур у пошуку чагосьці, пабудаванага падобным чынам. Гэты след — праз бактэрыяльны «скачучы ген» і механізм, якім звычайныя клеткі хімічна мадыфікуюць уласную РНК, — прывёў да сапраўды новага аб’екта.

Што зрабілі аўтары

Структурны пошук выявіў раней нераспазнанае сямейства бялкоў, якія кадуюцца пераважна бактэрыяфагамі (вірусамі, што заражаюць бактэрыі), вірусамі архей і малюсенькімі паразітычнымі бактэрыямі. Побач з кожным такім генам знаходзіцца характэрны ўчастак ДНК: доўгі паўтаральны масіў, які аўтары назвалі масівам TIGR (Tandem Interspaced Guide RNA). Самі бялкі яны назвалі Tas (TIGR-associated). Некаторыя бялкі Tas — толькі «заціск» для РНК; да іншых далучаны інструмент для разразання ДНК — адзін з двух тыпаў малекулярных нажніц, RuvC або HNH.

Знайшоўшы гэтае сямейства ў базах даных, даследчыкі перанеслі яго ў лабараторыю: экспрэсавалі сістэмы ў E. coli і секвенавалі малыя РНК, якія ўтвараюцца, высветлілі правілы, па якіх гэтыя РНК знаходзяць мішэнь у ДНК, праверылі, ці сапраўды варыянты з нуклеазамі рэжуць ДНК, паспрабавалі запраграмаваць адзін з іх для рэдагавання чалавечых клетак, а напрыканцы замарозілі працоўны комплекс і вызначылі яго структуру з амаль атамным раздзяленнем.

Што яны выявілі

Гід складаецца з дзвюх частак. Масіў TIGR апрацоўваецца ў кароткія РНК даўжынёй прыкладна 36 нуклеатыдаў, кожная з якіх змяшчае два асобныя накіравальныя сегменты. Адзін сегмент счытвае адзін ланцуг мішэневай ДНК, другі — супрацьлеглы. Разам яны фіксуюць комплекс на патрэбным участку. Гэта сапраўднае механістычнае адрозненне ад CRISPR, дзе гід адпавядае аднаму ланцугу адным бесперапынным участкам.

І яму не патрэбная «пасадачная пляцоўка». Многія нуклеазы CRISPR могуць рэзаць толькі побач з кароткім спецыфічным матывам ДНК («PAM»), размешчаным каля мішэні, — гэта абмяжоўвае месцы, на якія іх можна накіраваць. Для сістэм TIGR такога патрабавання не выявілі: яны абапіраліся толькі на саму паслядоўнасць мішэні. Сістэму, якой не патрэбны PAM, у прынцыпе можна накіроўваць на большую колькасць участкаў.

Варыянты з нуклеазамі рэжуць — і робяць гэта дакладна. Накіраваныя малой РНК бялкі Tas з даменамі RuvC або HNH стваралі чыстыя, спецыфічныя да паслядоўнасці разрывы ДНК — і нічога не рабілі без гіда.

Адзін варыянт удалося запраграмаваць для рэдагавання чалавечых клетак — ледзь-ледзь. Калі бялок Tas перанеслі ў чалавечыя клеткі ў культуры і накіравалі на шэсць розных генаў, ён сапраўды ўнёс змены, пацвердзіўшы, што сістэму можна праграмаваць і ў нашых клетках. Але эфектыўнасць была нізкай: у найлепшым выпадку рэдагаваліся некалькі працэнтаў клетак. Для параўнання, сучасныя аптымізаваныя інструменты CRISPR звычайна рэдагуюць значную долю клетак, у якія іх уводзяць. Гэта доказ таго, што сістэма можа працаваць, а не інструмент, які працуе добра.

Структура патлумачыла механізм — і намякнула на паходжанне. Візуалізаваны комплекс складаецца з люстрана-сіметрычнай пары бялкоў, якія ахопліваюць гідавую РНК у форме васьмёркі, тады як мішэневая ДНК праходзіць праз комплекс з рэзкім выгібам. Характэрна, што гэтая архітэктура вельмі нагадвае механізм у клетках роднасных нам арганізмаў — box C/D snoRNP, які накіроўвае хімічныя мадыфікацыі РНК, а не разразае ДНК.

Яе натуральная праца незразумелая. Калі аўтары экспрэсавалі адну з сістэм у E. coli, яна не абараняла клеткі ад чужых вірусаў або плазмід — гэта значыць не выконвала звычайную працу CRISPR. Замест гэтага на працягу многіх пакаленняў яна паступова выцясняла плазміду, на якую была накіраваная. Гэта намякае, што яе сапраўдная роля можа быць звязана з павольнай канкурэнцыяй паміж мабільнымі элементамі ДНК, а не з першай лініяй імуннай абароны. Але гэта быў штучны эксперымент у запазычаным клетачным кантэксце, таму сумленны адказ такі: пакуль ніхто не ведае, што гэтыя сістэмы робяць у прыродзе.

Што гэта, верагодна, азначае

Дзве рэчы — з розным узроўнем упэўненасці.

Першая, надзейная: вядомы свет РНК-накіраваных сістэм большы і разнастайнейшы, чым CRISPR і яго нядаўна знойдзеныя сваякі. TIGR-Tas — сапраўды асобная галіна са сваім двухкампанентным, незалежным ад PAM спосабам распазнавання ДНК. Гэта сапраўднае дапаўненне да карты.

Другая, больш глыбокая і спекулятыўная: паколькі механізм TIGR пабудаваны падобна да snoRNP, які мадыфікуе РНК у клетках накшталт нашых, і падобна да вядомага «скачучага гена», ён можа пазначаць эвалюцыйную сувязь паміж РНК-накіраванымі сістэмамі, арыентаванымі на мадыфікацыю РНК, і РНК-накіраванымі сістэмамі, арыентаванымі на ДНК, — магчыма, гэта адсутнае звяно ў гісторыі з’яўлення праграмуемых РНК-гідаў у розных формах жыцця.

Чаго гэта не даказвае

• Гэта не гатовы інструмент рэдагавання генаў. Рэдагаванне чалавечых клетак прадэманстравалі, але яно было слабым — у найлепшым выпадку некалькі працэнтаў. Гэта доказ праграмуемасці, а не спелы рэдактар, і да клінічнага прымянення вельмі далёка.
• Гэта не «CRISPR 2.0». Калі ацэньваць іх як інструменты сёння, CRISPR-Cas9 рэдагуе непараўнальна больш эфектыўна. TIGR-Tas — новая архітэктура на стадыі proof of concept, а не палепшаная версія гатовага прадукту.
• Яе біялагічная роля невядомая. У адным тэставанні гэтай ідэі сістэма не паводзіла сябе як супрацьвірусны імунны механізм; сцвярджэнне пра «новую бактэрыяльную імунную сістэму» не пацверджана.
• Многія дэталі базавага механізму застаюцца адкрытымі — у тым ліку як гідавая РНК абразаецца да канчатковай даўжыні і на што гэтыя сістэмы насамрэч накіраваныя ў прыродзе (большасць з іх паходзіць з мікробаў, якія мы амаль не ўмеем культываваць).
• Тут няма нічога тэрапеўтычнага. Гэта адкрыццё і характарыстыка сістэм у мікробах і клетачнай культуры — без хваробы, лячэння або пацыентаў.

Наколькі моцныя доказы?

Само адкрыццё стаіць на трывалым падмурку і даследавана незвычайна ўсебакова: яно абапіраецца на маштабны структурны пошук, лабараторнае пацверджанне таго, як утвараецца РНК і як яна знаходзіць і разразае ДНК, структуру актыўнага комплексу з амаль атамным раздзяленнем, а таксама тэст у чалавечых клетках. Сцвярджэнне «гэта новае, асобнае сямейства РНК-накіраваных сістэм нацэльвання на ДНК» падтрымліваецца адразу некалькімі незалежнымі лініямі доказаў.

Раннім застаецца ўсё, што тычыцца карыснасці: рэдагаванне працуе, але ледзь, і ўся аптымізацыя, якая ператварыла CRISPR з біялагічнай дзівосы ў інструмент, для TIGR яшчэ наперадзе. А высноўнай застаецца астатняя гісторыя: натуральная роля — абгрунтаванае дапушчэнне з аднаго штучнага эксперыменту, а эвалюцыйная сувязь, хоць і элегантная, — аргумент па агульнай структуры, а не ўсталяваная гісторыя. Артыкул акуратна адрознівае гэтыя ўзроўні ўпэўненасці.

Чаму гэта важна

Некалькі папярэдніх пашырэнняў каталогу РНК-накіраваных сістэм у выніку далі практычны плён. Сістэмы, якія ляжаць у аснове сучасных інструментаў — Cas9, Cas12, Cas13, а нядаўна таксама меншыя бялкі IscB/OMEGA і эўкарыятычныя Fanzor, — спачатку былі проста толькі што апісанай біялогіяй. Ніводная з іх не з’явілася як гатовы інструмент. Сістэма з двухкампанентным гідам і без патрабавання PAM — сапраўды іншая адпраўная кропка, а магчымасць нацэльвацца без PAM — менавіта той від гнуткасці, які цэняць распрацоўшчыкі малекулярных інструментаў.

Але больш ціхі вынік можа аказацца важнейшым за перспектыву новага інструмента. Звязваючы сістэму, якая разразае ДНК, з snoRNP-механізмам мадыфікацыі РНК і са «скачучым генам», праца намячае магчымую нітку, якая злучае вельмі розныя РНК-накіраваныя сістэмы на дрэве жыцця. Такія знаходкі перабудоўваюць уяўленне цэлай галіны пра паходжанне яе інструментаў — і ў доўгай перспектыве гэта каштоўней за яшчэ адзін гучны загаловак пра малекулярныя нажніцы.

Коратка

Шукаючы не падобныя паслядоўнасці, а формы бялкоў, даследчыкі адкрылі TIGR-Tas — раней невядомае сямейства РНК-накіраваных сістэм нацэльвання на ДНК, якое сустракаецца пераважна ў вірусаў бактэрый і паразітычных бактэрый. Яго гідавая РНК незвычайная: прыкладна 36 нуклеатыдаў з двума асобнымі накіравальнымі сегментамі, якія счытваюць супрацьлеглыя ланцугі ДНК; у адрозненне ад CRISPR ёй не патрэбны суседні матыў «PAM». Прадстаўнікі з нуклеазамі дакладна разразаюць ДНК, адзін з іх удалося запраграмаваць для рэдагавання чалавечых клетак (хоць з эфектыўнасцю ўсяго некалькі працэнтаў), а структура з амаль атамным раздзяленнем паказала комплекс, пабудаваны падобна да snoRNP-механізму, які мадыфікуе РНК у нашых клетках, — гэта намякае на глыбокую эвалюцыйную сувязь паміж РНК-накіраванымі сістэмамі мадыфікацыі РНК і сістэмамі нацэльвання на ДНК. Гэта сапраўднае пашырэнне вядомай біялогіі РНК-накіраваных сістэм і магчымае новае шасі для будучых інструментаў — фундаментальнае адкрыццё і proof of concept, не спелы рэдактар генаў, не «CRISPR 2.0» і не тэрапія. Яго натуральная роля ў прыродзе застаецца невядомай.

Праверка без ажыятажу

Што паказвае артыкул: Новае, асобнае сямейства РНК-накіраваных сістэм нацэльвання на ДНК (TIGR-Tas) у пракарыётаў і іх вірусаў, знойдзенае з дапамогай структурнага пошуку; двухсегментную гідавую РНК без патрабавання PAM (~36 нт), якая паслядоўна нацэльваецца на абодва ланцугі ДНК; дакладнае РНК-накіраванае расшчапленне ДНК прадстаўнікамі з нуклеазамі; праграмуемае рэдагаванне чалавечых клетак з нізкай эфектыўнасцю (да некалькіх працэнтаў); крыя-ЭМ-структуру з амаль атамным раздзяленнем; а таксама структурныя і эвалюцыйныя сувязі з box C/D snoRNP і транспазонамі IS110.

Што праўдападобна, але не даказана: Натуральная біялагічная роля гэтых сістэм (адзін штучны эксперымент намякае на неімунную ролю ў канкурэнцыі мабільных элементаў); прапанаваны эвалюцыйны мост паміж РНК-накіраванымі сістэмамі мадыфікацыі РНК і нацэльвання на ДНК (аргумент па структуры).

Чаго праца не паказвае: Спелага або высокаэфектыўнага інструмента рэдагавання генаў; перавагі над CRISPR як інструментам; пацверджанай натуральнай функцыі; механізму паспявання гідавай РНК; якога-небудзь тэрапеўтычнага прымянення.

Асноўныя абмежаванні: Эфектыўнасць рэдагавання чалавечых клетак нізкая (толькі proof of concept); большасць сістэм паходзіць з цяжкадаступных для даследавання метагеномаў, таму іх натуральныя мішэні пераважна невядомыя; сцвярджэнні пра біялагічную ролю і эвалюцыйнае паходжанне маюць высноўны характар; характарыстыка праведзена ў мікробах і клетачнай культуры, а не ў кантэксце якой-небудзь хваробы.

Колькі даверу варта мець звычайнаму чытачу? Высокі да таго, што гэта сапраўды новае, асобнае сямейства РНК-накіраваных сістэм нацэльвання на ДНК з новым двухкампанентным, незалежным ад PAM механізмам і што структурныя і эвалюцыйныя назіранні рэальныя. Гэтак жа высокі да таго, што гэта не гатовы інструмент рэдагавання генаў, не «CRISPR 2.0» і не тэрапія. Нізкі — да яго натуральнай ролі і да таго, наколькі далёка яно зойдзе як інструмент. Самая дарэчная пазіцыя: шчырая цікавасць да новай біялогіі і магчымага адсутнага эвалюцыйнага звяна — і цярпенне адносна прымяненняў, якія толькі пачынаюцца.