Μια νέα οικογένεια συστημάτων που στοχεύουν DNA με οδηγό RNA — διαφορετική από το CRISPR και όχι ακόμη εργαλείο γονιδιακής επεξεργασίας

Ένας νέος κλάδος στο δέντρο των μηχανών που καθοδηγούνται από RNA

Κάθε τόσο εμφανίζεται μια βιολογική εργασία φορτωμένη με έναν τίτλο που ποτέ δεν ζήτησε. Για αυτήν ήταν «ένα νέο CRISPR». Η πραγματική δουλειά είναι πιο ενδιαφέρουσα — και, όπως συνήθως, πιο μετριοπαθής.

Ας ξεκινήσουμε από αυτό που έκανε διάσημο το CRISPR: ένα σύστημα καθοδηγούμενο από RNA. Το τέχνασμα είναι ότι η πρωτεΐνη δεν χρειάζεται να είναι από κατασκευής προγραμματισμένη να αναγνωρίζει έναν συγκεκριμένο στόχο. Αντί γι’ αυτό μεταφέρει ένα μικρό κομμάτι RNA — έναν οδηγό — και πηγαίνει όπου ταιριάζει η αλληλουχία αυτού του οδηγού. Αλλάζεις τον οδηγό, αλλάζεις τον στόχο. Αυτή η δυνατότητα προγραμματισμού είναι ο λόγος που το CRISPR έγινε εργαλείο. Όμως το CRISPR δεν είναι το μόνο RNA-καθοδηγούμενο σύστημα στη φύση, και η ερώτηση αυτής της εργασίας είναι η υπομονετική: πόσα άλλα είδη υπάρχουν και τι μπορούν να μας μάθουν;

Για να τα αναζητήσουν, οι συγγραφείς δεν έψαξαν για ίδιες γονιδιακές αλληλουχίες — αυτές αλλάζουν υπερβολικά πολύ στη διάρκεια της εξέλιξης ώστε να αποκαλύπτουν μακρινούς συγγενείς. Έψαξαν για σχήματα. Ξεκινώντας από το τμήμα της πρωτεΐνης Cas9 του CRISPR που συγκρατεί το RNA-οδηγό, σάρωσαν βάσεις δεδομένων προβλεπόμενων πρωτεϊνικών δομών αναζητώντας οτιδήποτε ήταν χτισμένο με παρόμοιο τρόπο. Η διαδρομή αυτή οδήγησε — μέσω ενός βακτηριακού «πηδηχτού γονιδίου» και ενός μηχανισμού που χρησιμοποιούν τα συνηθισμένα κύτταρα για να τροποποιούν χημικά το δικό τους RNA — σε κάτι πραγματικά νέο.

Τι έκαναν οι συγγραφείς

Η δομική αναζήτηση αποκάλυψε μια οικογένεια πρωτεϊνών που δεν είχε αναγνωριστεί προηγουμένως, κωδικοποιημένων κυρίως σε βακτηριοφάγους (ιούς που μολύνουν βακτήρια), σε ιούς αρχαίων και σε πολύ μικρά παρασιτικά βακτήρια. Καθεμία βρίσκεται δίπλα σε μια χαρακτηριστική περιοχή DNA: μια μακριά, επαναλαμβανόμενη συστοιχία που οι συγγραφείς ονόμασαν TIGR array (Tandem Interspaced Guide RNA). Τις πρωτεΐνες τις ονόμασαν Tas (TIGR-associated). Ορισμένες πρωτεΐνες Tas αποτελούνται ουσιαστικά μόνο από το τμήμα που συγκρατεί RNA· άλλες έχουν προσαρτημένο ένα εργαλείο κοπής DNA — ένα από δύο είδη μοριακών «ψαλιδιών», που λέγονται RuvC ή HNH.

Αφού βρήκαν την οικογένεια στη βάση δεδομένων, τη μετέφεραν στο εργαστήριο: εξέφρασαν τα συστήματα σε E. coli και αλληλούχησαν τα μικρά RNA που παρήγαγαν, προσδιόρισαν τους κανόνες με τους οποίους αυτά τα RNA βρίσκουν έναν στόχο DNA, έλεγξαν αν οι εκδοχές με νουκλεάση πράγματι κόβουν, προσπάθησαν να προγραμματίσουν μία ώστε να επεξεργάζεται ανθρώπινα κύτταρα και, τέλος, ακινητοποίησαν ένα ενεργό σύμπλοκο και απεικόνισαν τη δομή του σε σχεδόν ατομική ανάλυση.

Τι βρήκαν

Ο οδηγός αποτελείται από δύο τμήματα. Η συστοιχία TIGR επεξεργάζεται σε μικρά RNA μήκους περίπου 36 «γραμμάτων», καθένα από τα οποία φέρει δύο ξεχωριστά τμήματα στόχευσης. Το ένα διαβάζει τη μία αλυσίδα του DNA-στόχου· το άλλο διαβάζει την αντίθετη. Τα δύο λειτουργούν από κοινού για να καθορίσουν τη θέση. Πρόκειται για πραγματική μηχανιστική απόκλιση από το CRISPR, του οποίου ο οδηγός ταιριάζει σε μία αλυσίδα σε ένα συνεχόμενο τμήμα.

Και δεν χρειάζεται «σημείο προσγείωσης». Πολλές νουκλεάσες CRISPR μπορούν να κόψουν μόνο δίπλα σε ένα μικρό, συγκεκριμένο μοτίβο DNA (ένα «PAM») που βρίσκεται παραπλεύρως του στόχου — περιορισμός που μειώνει τις θέσεις στις οποίες μπορούν να κατευθυνθούν. Τα συστήματα TIGR δεν έδειξαν τέτοια απαίτηση: βασίζονταν μόνο στην αλληλουχία-στόχο. Ένα σύστημα που δεν χρειάζεται PAM μπορεί, κατ’ αρχήν, να στοχεύσει περισσότερες θέσεις.

Οι εκδοχές που κόβουν, κόβουν με ακρίβεια. Καθοδηγούμενες από το μικρό RNA, οι πρωτεΐνες Tas που έφεραν RuvC ή HNH προκάλεσαν καθαρές, ειδικές ως προς την αλληλουχία θραύσεις στο DNA — και δεν έκαναν τίποτα χωρίς τον οδηγό.

Μία εκδοχή μπορούσε να προγραμματιστεί ώστε να επεξεργάζεται ανθρώπινα κύτταρα — αλλά μετά βίας. Όταν μεταφέρθηκε σε ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια και κατευθύνθηκε σε έξι διαφορετικά γονίδια, μια πρωτεΐνη Tas όντως προκάλεσε επεξεργασίες, επιβεβαιώνοντας ότι το σύστημα είναι προγραμματιζόμενο και στα δικά μας κύτταρα. Όμως η αποδοτικότητα ήταν χαμηλή: στην καλύτερη περίπτωση λίγα τοις εκατό των κυττάρων. Για σύγκριση, τα σημερινά βελτιστοποιημένα εργαλεία CRISPR επεξεργάζονται συνήθως μεγάλο ποσοστό των κυττάρων στα οποία εισάγονται. Αυτό αποδεικνύει ότι μπορεί να λειτουργήσει, όχι ότι είναι εργαλείο που λειτουργεί καλά.

Η δομή εξήγησε τον μηχανισμό — και έδωσε ένα ίχνος για την προέλευσή του. Το σύμπλοκο που απεικονίστηκε είναι ένα κατοπτρικά συμμετρικό ζεύγος πρωτεϊνών που αγκαλιάζει το RNA-οδηγό σε σχήμα οκτώ, ενώ το DNA-στόχος κάμπτεται απότομα. Εντυπωσιακά, αυτή η αρχιτεκτονική μοιάζει πολύ με έναν μηχανισμό που υπάρχει σε συγγενείς των δικών μας κυττάρων — το box C/D «snoRNP», το οποίο καθοδηγεί χημικές τροποποιήσεις του RNA αντί να κόβει DNA.

Η φυσική του λειτουργία είναι ασαφής. Όταν οι συγγραφείς εξέφρασαν ένα σύστημα σε E. coli, αυτό δεν απέκρουσε εισβάλλοντες ιούς ή πλασμίδια — τη συνηθισμένη δουλειά του CRISPR. Αντί γι’ αυτό, απομάκρυνε σταδιακά ένα στοχευμένο πλασμίδιο σε πολλές γενιές, υποδηλώνοντας ότι ο πραγματικός του ρόλος ίσως βρίσκεται σε αργό ανταγωνισμό ανάμεσα σε κινητά στοιχεία DNA και όχι στην πρώτη γραμμή της ανοσολογικής άμυνας. Όμως αυτό συνέβη σε ένα δανεικό, τεχνητό περιβάλλον και η ειλικρινής απάντηση είναι ότι ακόμη κανείς δεν γνωρίζει τι κάνουν αυτά τα συστήματα στη φύση.

Τι πιθανότατα σημαίνει αυτό

Δύο πράγματα, με διαφορετικό βαθμό βεβαιότητας.

Το στέρεο: ο γνωστός κόσμος των RNA-καθοδηγούμενων συστημάτων είναι μεγαλύτερος και πιο ποικίλος από το CRISPR και τους συγγενείς του που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα. Το TIGR-Tas είναι πραγματικά ξεχωριστός κλάδος, με δικό του τρόπο αναγνώρισης DNA, δύο τμημάτων και χωρίς PAM. Είναι μια πραγματική προσθήκη στον χάρτη.

Το βαθύτερο και πιο υποθετικό: επειδή ο μηχανισμός TIGR είναι δομημένος σαν το snoRNP που τροποποιεί RNA σε κύτταρα όπως τα δικά μας και σαν ένα γνωστό «πηδηχτό γονίδιο», ίσως αποτελεί εξελικτικό σύνδεσμο ανάμεσα σε συστήματα καθοδηγούμενα από RNA που τροποποιούν RNA και σε συστήματα καθοδηγούμενα από RNA που στοχεύουν DNA — ένα πιθανό κομμάτι που έλειπε από την ιστορία του πώς προέκυψαν προγραμματιζόμενοι οδηγοί RNA στη ζωή.

Τι δεν αποδεικνύει

• Δεν είναι έτοιμο εργαλείο γονιδιακής επεξεργασίας. Η επεξεργασία ανθρώπινων κυττάρων αποδείχθηκε, αλλά ήταν ασθενής — λίγα τοις εκατό στην καλύτερη περίπτωση. Αυτό αποδεικνύει προγραμματισιμότητα, όχι ώριμο επεξεργαστή, και απέχει πολύ από οτιδήποτε κλινικό.
• Δεν είναι «CRISPR 2.0». Ως σημερινό εργαλείο, το CRISPR-Cas9 το ξεπερνά κατά πολύ σε αποδοτικότητα επεξεργασίας. Το TIGR-Tas είναι μια νέα αρχιτεκτονική στο στάδιο της απόδειξης αρχής, όχι καλύτερη εκδοχή ενός ήδη υπάρχοντος προϊόντος.
• Ο βιολογικός του ρόλος είναι άγνωστος. Δεν λειτούργησε ως αντι-ιικό ανοσοποιητικό σύστημα στη μία δοκιμή αυτής της ιδέας· δεν έχει τεκμηριωθεί «ένα νέο βακτηριακό ανοσοποιητικό σύστημα».
• Μεγάλο μέρος του βασικού μηχανισμού παραμένει ανοικτό — μεταξύ άλλων πώς κόβεται το RNA-οδηγός στο τελικό του μήκος και τι στοχεύουν πραγματικά αυτά τα συστήματα στη φύση (τα περισσότερα βρίσκονται σε μικρόβια που μετά βίας μπορούμε να καλλιεργήσουμε).
• Δεν υπάρχει εδώ θεραπευτική εφαρμογή. Πρόκειται για ανακάλυψη και χαρακτηρισμό σε μικρόβια και κυτταροκαλλιέργειες — χωρίς νόσο, χωρίς θεραπεία, χωρίς ασθενή.

Πόσο ισχυρά είναι τα στοιχεία;

Η ίδια η ανακάλυψη πατά σε στέρεο έδαφος και είναι ασυνήθιστα ολοκληρωμένη: βασίζεται σε μεγάλης κλίμακας εξόρυξη δομών, έπειτα σε εργαστηριακή επιβεβαίωση του πώς παράγεται το RNA και πώς βρίσκει και κόβει DNA, κατόπιν σε σχεδόν ατομική δομή του ενεργού συμπλόκου, μαζί με τη δοκιμή σε ανθρώπινα κύτταρα. Ο ισχυρισμός «αυτή είναι μια νέα, διακριτή οικογένεια RNA-καθοδηγούμενης στόχευσης DNA» υποστηρίζεται καλά από πολλές ανεξάρτητες κατευθύνσεις.

Αυτό που βρίσκεται σε πολύ πρώιμο στάδιο είναι οτιδήποτε αφορά τη χρησιμότητα: η επεξεργασία λειτουργεί, αλλά μόλις και μετά βίας, και όλη η βελτιστοποίηση που μετέτρεψε το CRISPR από περιέργεια σε εργαλείο βρίσκεται, για το TIGR, ακόμη μπροστά. Και αυτό που είναι συμπερασματικό είναι το υπόλοιπο της ιστορίας — ο φυσικός ρόλος είναι μια λογική υπόθεση από ένα τεχνητό πείραμα, ενώ ο εξελικτικός σύνδεσμος, αν και κομψός, είναι επιχείρημα από κοινή δομή και όχι οριστικά καταγεγραμμένη ιστορία. Η εργασία προσέχει να ξεχωρίζει τα δύο.

Γιατί έχει σημασία

Αρκετές προηγούμενες διευρύνσεις του καταλόγου των RNA-καθοδηγούμενων συστημάτων απέδωσαν τελικά. Τα συστήματα πίσω από τα σημερινά εργαλεία — Cas9, Cas12, Cas13 και, πιο πρόσφατα, οι μικρότερες πρωτεΐνες IscB/OMEGA και οι ευκαρυωτικές Fanzors — ήταν το καθένα, στην αρχή, απλώς νεοπεριγραφείσα βιολογία. Κανένα δεν εμφανίστηκε ως τελειωμένο εργαλείο. Ένα σύστημα με οδηγό δύο τμημάτων και χωρίς απαίτηση PAM είναι ένα πραγματικά διαφορετικό σημείο εκκίνησης, και η στόχευση χωρίς PAM είναι ακριβώς το είδος ευελιξίας που εκτιμούν όσοι κατασκευάζουν εργαλεία.

Όμως το πιο ήσυχο αποτέλεσμα ίσως έχει μεγαλύτερη σημασία από την προοπτική ενός εργαλείου. Συνδέοντας ένα σύστημα που κόβει DNA με τον μηχανισμό snoRNP που τροποποιεί RNA και με ένα πηδηχτό γονίδιο, η εργασία σκιαγραφεί ένα πιθανό νήμα που ενώνει πολύ διαφορετικά RNA-καθοδηγούμενα συστήματα σε όλο το δέντρο της ζωής. Είναι το είδος ευρήματος που αναδιοργανώνει τον τρόπο με τον οποίο ένας κλάδος αντιλαμβάνεται από πού προήλθαν τα εργαλεία του — κάτι που μακροπρόθεσμα αξίζει περισσότερο από ακόμη έναν τίτλο για «ψαλίδια».

Καθαρή σύνοψη

Αναζητώντας σχήματα πρωτεϊνών αντί για αλληλουχίες, οι ερευνητές ανακάλυψαν το TIGR-Tas: μια άγνωστη μέχρι σήμερα οικογένεια RNA-καθοδηγούμενων συστημάτων στόχευσης DNA, που βρίσκεται κυρίως σε βακτηριακούς ιούς και παρασιτικά βακτήρια. Το RNA-οδηγός της είναι ασυνήθιστο — περίπου 36 «γράμματα» με δύο ξεχωριστά τμήματα στόχευσης που διαβάζουν αντίθετες αλυσίδες του DNA — και, σε αντίθεση με το CRISPR, δεν χρειάζεται γειτονικό μοτίβο «PAM». Τα μέλη που φέρουν νουκλεάση κόβουν DNA με ακρίβεια, ένα από αυτά μπορούσε να προγραμματιστεί για επεξεργασία ανθρώπινων κυττάρων (αν και με αποδοτικότητα μόνο λίγων τοις εκατό) και μια σχεδόν ατομική δομή αποκάλυψε ένα σύμπλοκο χτισμένο όπως ο μηχανισμός snoRNP που τροποποιεί RNA στα δικά μας κύτταρα — υποδηλώνοντας έναν βαθύ εξελικτικό σύνδεσμο ανάμεσα σε RNA-καθοδηγούμενα συστήματα τροποποίησης RNA και στόχευσης DNA. Πρόκειται για πραγματική διεύρυνση της RNA-καθοδηγούμενης βιολογίας και για έναν πιθανό νέο «σκελετό» μελλοντικών εργαλείων — ανακάλυψη βασικής επιστήμης και απόδειξη αρχής, όχι ώριμος γονιδιακός επεξεργαστής, όχι «CRISPR 2.0» και όχι θεραπεία. Η φυσική του λειτουργία στη φύση παραμένει άγνωστη.

Έλεγχος χωρίς υπερβολές

Τι δείχνει η εργασία: Μια νέα, διακριτή οικογένεια RNA-καθοδηγούμενων συστημάτων στόχευσης DNA (TIGR-Tas) σε προκαρυώτες και τους ιούς τους, που βρέθηκε μέσω δομικής εξόρυξης· έναν οδηγό RNA δύο τμημάτων, χωρίς PAM (~36 nt), που στοχεύει διαδοχικά και τις δύο αλυσίδες DNA· ακριβή RNA-καθοδηγούμενη κοπή DNA από τα μέλη που φέρουν νουκλεάση· προγραμματιζόμενη επεξεργασία ανθρώπινων κυττάρων με χαμηλή αποδοτικότητα (έως λίγα τοις εκατό)· μια σχεδόν ατομική δομή cryo-EM· και δομικές/εξελικτικές συνδέσεις με box C/D snoRNP και τρανσποζόνια IS110.

Τι είναι εύλογο αλλά δεν έχει αποδειχθεί: Ο φυσικός βιολογικός ρόλος αυτών των συστημάτων (ένα μη αμυντικό ρόλο στον ανταγωνισμό κινητών στοιχείων υποδηλώνει ένα τεχνητό πείραμα)· ο προτεινόμενος εξελικτικός σύνδεσμος ανάμεσα σε RNA-καθοδηγούμενα συστήματα τροποποίησης RNA και στόχευσης DNA (επιχείρημα από τη δομή).

Τι δεν δείχνει: Ένα ώριμο ή υψηλής αποδοτικότητας εργαλείο γονιδιακής επεξεργασίας· υπεροχή έναντι του CRISPR ως εργαλείου· επιβεβαιωμένη φυσική λειτουργία· τον τρόπο ωρίμανσης του RNA-οδηγού· οποιαδήποτε θεραπευτική εφαρμογή.

Κύριοι περιορισμοί: Η αποδοτικότητα επεξεργασίας σε ανθρώπινα κύτταρα είναι χαμηλή (μόνο απόδειξη αρχής)· τα περισσότερα συστήματα βρίσκονται σε δύσκολα μελετήσιμα μεταγονιδιώματα, άρα οι φυσικοί στόχοι παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι· οι ισχυρισμοί για τον βιολογικό ρόλο και την εξελικτική προέλευση είναι συμπερασματικοί· ο χαρακτηρισμός έγινε σε μικρόβια και κυτταροκαλλιέργεια, όχι σε πλαίσιο νόσου.

Πόση εμπιστοσύνη πρέπει να έχει ένας γενικός αναγνώστης; Υψηλή ότι πρόκειται για πραγματική, διακριτή νέα οικογένεια RNA-καθοδηγούμενων συστημάτων στόχευσης DNA με νέο μηχανισμό δύο τμημάτων χωρίς PAM και ότι οι δομικές και εξελικτικές παρατηρήσεις είναι πραγματικές. Υψηλή επίσης ότι δεν είναι έτοιμο εργαλείο γονιδιακής επεξεργασίας, δεν είναι «CRISPR 2.0» και δεν είναι θεραπεία. Χαμηλή για τον φυσικό του ρόλο και για το πόσο μακριά θα φτάσει ως εργαλείο. Η κατάλληλη στάση: πραγματικός ενθουσιασμός για νέα βιολογία και έναν πιθανό εξελικτικό χαμένο κρίκο — και υπομονή για τις εφαρμογές, που βρίσκονται μόλις στην αρχή.